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Resumo(s)
Machado-Joseph Disease (MJD), or Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3), is a dominantly inherited neurodegenerative disorder caused by CAG repeat expansion in the ATXN3 gene, resulting in a polyglutamine-expanded ataxin-3 protein that forms toxic intranuclear aggregates. With no current disease-modifying therapies, novel approaches targeting the molecular and cellular basis of MJD are urgently needed. This study evaluated the therapeutic potential of neuroepithelial stem cells (Nesc) derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs), both CNT (not bearing the mutant ataxin-3) (CNT NESC) and MJD cells genetically engineered with allele-specific shRNAs targeting mutant ATXN3 RNA (Silenced MJD NESC), following striatal transplantation in NOD/SCID mice injected with lentivirus encoding for mutant ataxin-3 ( lentiviral-induced MJD mouse model). Our results demonstrate that both CNT and silenced MJD NESC are prone to survive up to eight weeks after transplantation into the striatum of NOD/SCID mice also injected with lentivirus encoding for mutant ataxin-3. Both cell types triggered a tendency reduction in the size of the inclusions. Western blot analysis showed a modest, non-significant decrease in high-molecular-weight ATXN3 aggregates in the silenced MJD NESC group. Additionally, no significant differences were observed between CNT mice and CNT and Silenced MJD NESC groups regarding microglia recruitment. RT-qPCR analysis revealed that the striatum of mice transplanted with CNT NESC and Silenced MJD NESC expressed higher Notch1 mRNA levels, and tendency increased for both Bdnf and Ngf mRNA levels. These results demonstrated the ability of NESC to trigger the bystander effects and enhance neurogenesis-related and neurotrophic factors levels after transplantation in the lentiviral-induced MJD mouse model. Collectively, these findings support the therapeutic promise of combining targeted gene silencing of MJD patients’ iPSC-derived NESC with NESC transplantation in MJD mouse models.
A Doença de Machado-Joseph (MJD), também conhecida como Ataxia Espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), é uma doença neurodegenerativa herdada de forma autossómica dominante, causada pela expansão de repetições CAG no gene ATXN3. Esta mutação leva à produção de uma proteína ataxina-3 mutante, que forma agregados intranucleares tóxicos, contribuindo para a disfunção e degeneração neuronal progressiva. Dada a ausência de terapias ou uma cura para esta doença, há uma necessidade urgente de estratégias inovadoras que atuem sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes. Entre as abordagens emergentes, a utilização de células estaminais neuroepiteliais (Nesc) derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) humanas apresentam um elevado potencial terapêutico. As iPSCs podem ser reprogramadas a partir de células somáticas adultas e induzidas em Nesc. As Nesc são células multipotentes comprometidas na linhagem neuroectoderme, e portanto capazes de originar neurónios e células gliais após diferenciação. Para além do potencial de substituição celular, nomeadamente de neurónios mortos, as Nesc podem exercer efeitos parácrinos benéficos, como promover suporte neurotrófico e modulação de respostas neuroinflamatórias e da neurogénese no hospedeiro. Neste estudo, avaliou-se o potencial terapêutico no estriado de um modelo MJD de murganho induzido por lentivírus do transplante de Nesc CNT (sem ataxina-3 mutante) (CNT NESC) e NESC MJD geneticamente modificadas com RNA de interferência, utilizando moléculas short-hairpin RNA (shRNA) específico para o alelo mutado do gene ATXN3 (Silenced MJD NESC). O shRNA foi desenhado para suprimir seletivamente a expressão do alelo expandido, preservando a forma da ataxina-3 wild-type, com o objetivo de reduzir a proteotoxicidade da proteína ataxina-3 mutante sem comprometer a função fisiológica da proteína ataxina-3 wild-type. As análises realizadas oito semanas após o transplante demonstraram sobrevivência robusta dos enxertos celulares, evidenciada por imunohistoquímica para STEM101. Deste modo, os nossos resultados demonstram que tanto CNT NESC como NESC MJD silenciadas têm capacidade de sobreviver até oito semanas após o transplante no estriado de ratinhos NOD/SCID também injetados com lentivírus que codifica a ataxina-3 mutante. Ambos os tipos de células desencadearam uma tendência no sentido de redução no tamanho das inclusões. A análise de Western blot mostrou uma diminuição modesta e não significativa dos agregados de ATXN3 de alto peso molecular no grupo NESC MJD silenciadas. Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre os murganhos CNT e os grupos CNT NESC e NESC MJD silenciadas em relação ao recrutamento de micróglia. A análise de RT-qPCR revelou que o estriado dos murganhos transplantados com NESC CNT e NESC MJD silenciadas expressaram níveis mais elevados de mRNA de Notch1, e uma tendência para aumento dos níveis de mRNA de Bdnf e Ngf. Estes resultados demonstraram a capacidade do NESC de desencadear os efeitos secundários e aumentar os níveis de fatores neurotróficos e moléculas relacionadas com a neurogénese após o transplante no modelo murino de MJD induzido por lentivírus. Apesar dos resultados promissores, algumas limitações devem ser reconhecidas. O tamanho reduzido da amostra pode ter comprometido o poder estatístico da análise.. Adicionalmente, a irregularidade entre os dados histológicos e bioquímicos de certos marcadores, como o Iba-1, destaca a necessidade de validação multimodal. Avaliações comportamentais não foram incluídas neste estudo, mas serão cruciais em investigações futuras para se estabelecerem correlações funcionais das alterações moleculares observadas. Em conclusão, os resultados indicam que o transplante de CNT Nesc e CNT NESC NESC MJD silenciadas podem reduzir a formação de agregados de maiores dimensões, patológicos e, promover um ambiente mais favorável à neuroproteção na MJD. A combinação de silenciamento genético específico de células MJD NESC com subsequente transplante destas células representa uma abordagem terapêutica promissora a ser explorada em futuros estudos pré-clínicos.
A Doença de Machado-Joseph (MJD), também conhecida como Ataxia Espinocerebelosa tipo 3 (SCA3), é uma doença neurodegenerativa herdada de forma autossómica dominante, causada pela expansão de repetições CAG no gene ATXN3. Esta mutação leva à produção de uma proteína ataxina-3 mutante, que forma agregados intranucleares tóxicos, contribuindo para a disfunção e degeneração neuronal progressiva. Dada a ausência de terapias ou uma cura para esta doença, há uma necessidade urgente de estratégias inovadoras que atuem sobre os mecanismos moleculares e celulares subjacentes. Entre as abordagens emergentes, a utilização de células estaminais neuroepiteliais (Nesc) derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) humanas apresentam um elevado potencial terapêutico. As iPSCs podem ser reprogramadas a partir de células somáticas adultas e induzidas em Nesc. As Nesc são células multipotentes comprometidas na linhagem neuroectoderme, e portanto capazes de originar neurónios e células gliais após diferenciação. Para além do potencial de substituição celular, nomeadamente de neurónios mortos, as Nesc podem exercer efeitos parácrinos benéficos, como promover suporte neurotrófico e modulação de respostas neuroinflamatórias e da neurogénese no hospedeiro. Neste estudo, avaliou-se o potencial terapêutico no estriado de um modelo MJD de murganho induzido por lentivírus do transplante de Nesc CNT (sem ataxina-3 mutante) (CNT NESC) e NESC MJD geneticamente modificadas com RNA de interferência, utilizando moléculas short-hairpin RNA (shRNA) específico para o alelo mutado do gene ATXN3 (Silenced MJD NESC). O shRNA foi desenhado para suprimir seletivamente a expressão do alelo expandido, preservando a forma da ataxina-3 wild-type, com o objetivo de reduzir a proteotoxicidade da proteína ataxina-3 mutante sem comprometer a função fisiológica da proteína ataxina-3 wild-type. As análises realizadas oito semanas após o transplante demonstraram sobrevivência robusta dos enxertos celulares, evidenciada por imunohistoquímica para STEM101. Deste modo, os nossos resultados demonstram que tanto CNT NESC como NESC MJD silenciadas têm capacidade de sobreviver até oito semanas após o transplante no estriado de ratinhos NOD/SCID também injetados com lentivírus que codifica a ataxina-3 mutante. Ambos os tipos de células desencadearam uma tendência no sentido de redução no tamanho das inclusões. A análise de Western blot mostrou uma diminuição modesta e não significativa dos agregados de ATXN3 de alto peso molecular no grupo NESC MJD silenciadas. Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre os murganhos CNT e os grupos CNT NESC e NESC MJD silenciadas em relação ao recrutamento de micróglia. A análise de RT-qPCR revelou que o estriado dos murganhos transplantados com NESC CNT e NESC MJD silenciadas expressaram níveis mais elevados de mRNA de Notch1, e uma tendência para aumento dos níveis de mRNA de Bdnf e Ngf. Estes resultados demonstraram a capacidade do NESC de desencadear os efeitos secundários e aumentar os níveis de fatores neurotróficos e moléculas relacionadas com a neurogénese após o transplante no modelo murino de MJD induzido por lentivírus. Apesar dos resultados promissores, algumas limitações devem ser reconhecidas. O tamanho reduzido da amostra pode ter comprometido o poder estatístico da análise.. Adicionalmente, a irregularidade entre os dados histológicos e bioquímicos de certos marcadores, como o Iba-1, destaca a necessidade de validação multimodal. Avaliações comportamentais não foram incluídas neste estudo, mas serão cruciais em investigações futuras para se estabelecerem correlações funcionais das alterações moleculares observadas. Em conclusão, os resultados indicam que o transplante de CNT Nesc e CNT NESC NESC MJD silenciadas podem reduzir a formação de agregados de maiores dimensões, patológicos e, promover um ambiente mais favorável à neuroproteção na MJD. A combinação de silenciamento genético específico de células MJD NESC com subsequente transplante destas células representa uma abordagem terapêutica promissora a ser explorada em futuros estudos pré-clínicos.
Descrição
Palavras-chave
MJD NESC derivadas de iPSC shRNA Transplante cerebral Agregação de ataxina-3 mutante Neuroinflamação Fatores neurotróficos Murganhos NOD/SCID