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Konjac glucomannan microcarriers: an application in the treatment of pulmonary tuberculosis
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Authors
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Abstract(s)
Tuberculosis remains one of the leading causes of death worldwide.1 The conventional therapy of this infection is based on the intake of a combination of several antitubercular drugs for a period that could reach 2 years.2 The prolonged treatment of tuberculosis has limited the therapeutic success, as it fosters the non-compliance of the patient and, consequently, the emergence of drug resistance.3 Thus, the development of new approaches to treat tuberculosis is demanded to address the limitations of the current treatment. Considering that 80% of tuberculosis cases are pulmonary, the direct delivery of antitubercular drugs to the lungs has been explored as therapeutic alternative in recent years. This approach is thought to potentially allow to decrease the dose and frequency of drug administration, while reducing the treatment duration and the systemic side effects associated to the conventional therapy of tuberculosis.4 Its success requires the engineering of suitable carriers, which must reach the alveolar region, where the macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis are located, and undergo phagocytosis by these cells.5 On the other side, specific receptors existing on macrophage surface may be used as drug targets in a strategy where drug carriers may, again, play a relevant role. At this moment, there are few excipients approved for pulmonary delivery applications, which hinders the development of drug carriers.6 The work entailing this PhD thesis proposes the development of inhalable microparticles based on konjac glucomannan (KGM), which are targeted to the alveolar macrophages. KGM is a polysaccharide composed by mannose and glucose units.7 The rational beyond the proposed strategy relies on the fact that the presence of mannose on KGM microparticles may mediate a preferential recognition by the mannose receptors present on the macrophage surface and potentiate their phagocytosis via these receptors.8 Inhalable microparticles were produced in the form of dry powders by a technique of spray-drying. In order to have KGM with the suitable properties for microparticle production using this technique, the polymer was initially submitted to an acid hydrolysis, which was demonstrated to not affect its physicochemical characteristics (composition and glucose/mannose ratio) and permitted a successful processing by spray-drying to produce microparticles. Isoniazid (INH) and rifabutin (RFB) are first-line antitubercular drugs and were associated to KGM microparticles as model drugs. Various formulations of drug-loaded KGM microparticles were produced (KGM/INH/RFB = 10/1/0.5, 10/1/1, 10/2/0.5, w/w) and subsequently characterised. Drug association efficiency varied within 66% and 91%, and the release of the drugs in conditions resembling the alveolar environment showed slower release of RFB compared with INH, but complete release of both drugs within 24 h. Regarding to the aerodynamic characteristics, which are of utmost importance in lung delivery strategies, KGM microparticles exhibited aerodynamic diameters around 3 μm, regardless of the drug amounts, which evidences suitability to reach the alveolar zone. Additionally, the spherical shape and the geometric size of approximately 2 μm displayed by KGM microparticles has proven adequate for macrophage internalisation, as shown in an in vitro assay. In fact, approximately 100% of macrophage-like THP-1 cells in culture demonstrated to phagocytose the microparticles. Despite the uptake was demonstrated, macrophage activation upon exposure to microparticles was not observed.
As mentioned before, a relevant limitation of the pulmonary drug delivery field relies on the shortness of excipients approved for inhalation. One of the main reasons for that is the unknown fate of materials after deposition in the lungs. In this work, the swelling of (unloaded) KGM microparticles was observed to occur (40% - 50%) upon liquid contact, but size reduction (> 62% in 90 min) in presence of β-mannosidase, an enzyme present in the lung, was further demonstrated, indicating potential biodegradability upon inhalation.
The preservation of antibacterial effect of the used drugs after spray-drying was demonstrated using Mycobacterium bovis, evidencing an absence of effect of the process of microencapsulation. In fact, the minimum inhibitory concentration (MIC) remained similar to that determined for the free drugs. However, a preliminary study indicated that the amount of drug corresponding to MIC was not enough to kill the bacteria after infection of the macrophages (macrophage-like THP-1 cells) with M. bovis. The number of bacteria surviving in macrophages only decreased on the ninth day of infection. Moreover, the continued exposure of bacteria to KGM microparticles for 7 days suggested the development of a certain degree of drug resistance by M. bovis. Finally, to better support the proposal of using KGM in lung delivery applications, the safety of KGM microparticles was evaluated in vitro and in vivo. With regards to the in vitro tests, these focused on the evaluation of toxicological profile in respiratory cells (alveolar epithelium and macrophages). Despite a wide range of concentrations was assessed to have a more comprehensive knowledge on the effect of the material and the developed drug carrier, at the concentrations expected to be realistic in approaches of lung delivery (up to 125 μg/mL) drug-loaded KGM microparticles did not show overt cell toxicity. An in vivo assay was also performed which focused on evaluating the toxicity of the material itself, as it is not approved for lung delivery applications. Mice receiving daily administration of unloaded KGM microparticles by inhalation for a period of two weeks have shown no signs of systemic or lung inflammatory response, which is in line with the results of macrophage activation obtained in vitro. Moreover, histological examination of the lung revealed no differences upon inhalation, comparing with control naïve mice, although some unexpected observations transversal to all groups require clarification. The results further demonstrated the development of eosinophilia, which is typically associated to allergic reactions. Nevertheless, no alterations were observed in serum IgE upon inhalation, which opposes to the eosinophilic effect. Overall, despite some positive indications, regulations on safety evaluation include a vast number of parameters to assess and further studies are required to deepen the assessment and support the safety of KGM for lung delivery applications.
Considering the whole set of data generated throughout the work, encouraging indications were given on the potential of KGM to be used as a pharmaceutical excipient in the formulation of inhalable antitubercular drug carriers for pulmonary tuberculosis treatment and, potentially, in other applications benefiting from macrophage targeting.
A tuberculose continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo.1 A terapia convencional desta infeção baseia-se na administração oral de uma combinação de vários fármacos tuberculostáticos por um período de tempo que pode alcançar os 2 anos.2 O tratamento prolongado da tuberculose tem limitado a sua terapêutica, pois favorece a não adesão do paciente ao tratamento e, consequentemente, o aparecimento de resistência aos antibióticos.3 Desta forma, é necessário o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da tuberculose com o objetivo de ultrapassar as limitações do tratamento atual. Considerando que 80% dos casos são de tuberculose pulmonar, a administração direta de fármacos tuberculostáticos nos pulmões tem sido explorada nos últimos anos como uma alternativa terapêutica. Acredita-se que esta abordagem permitirá diminuir a dose e a frequência de administração dos antibióticos, enquanto reduz a duração do tratamento e os possíveis efeitos sistémicos associados à terapia convencional da tuberculose.4 O sucesso desta abordagem depende da engenharia de transportadores com características adequadas, os quais devem chegar à região alveolar, onde os macrófagos infetados com Mycobacterium tuberculosis estão localizados, e serem internalizados por estas células.5 Por outro lado, recetores específicos presentes na superfície dos macrófagos podem ser usados como alvos terapêuticos para a entrega dos fármacos, uma estratégia na qual os transportadores têm novamente uma função relevante. Neste momento, existem poucos excipientes aprovados para aplicações na entrega pulmonar de fármacos, o que dificulta o desenvolvimento dos transportadores.6 O trabalho desenvolvido nesta tese de doutoramento propõe o desenvolvimento de micropartículas inaláveis à base de glucomanano de konjac (KGM) direcionadas para os macrófagos alveolares. O KGM é um polissacarídeo composto por unidades de manose e glucose.7 Esta abordagem foca-se na presença de manose nas micropartículas de KGM, a qual poderá mediar um reconhecimento preferencial pelos recetores de manose presentes na superfície dos macrófagos alveolares e potenciar a sua fagocitose através destes.8 As micropartículas inaláveis foram produzidas na forma de pós secos por uma técnica de secagem por pulverização, a atomização. Para que o KGM tivesse as propriedades adequadas para a produção de micropartículas por meio desta técnica, o polímero foi inicialmente submetido a uma hidrólise ácida, a qual demonstrou não afetar as suas características físico-químicas (composição e ratio glucose/manose) e permitiu a sua atomização para a produção das micropartículas. A isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB), dois fármacos tuberculostáticos de primeira linha usados na clínica da tuberculose, foram associadas às micropartículas de KGM como fármacos modelo. Várias formulações de micropartículas de KGM com os dois antibióticos foram produzidas (KGM/INH/RFB = 10/1/0,5, 10/1/1, 10/2/0,5, m/m) e posteriormente caracterizadas. A eficácia de associação dos fármacos variou entre 66% e 91%, e a libertação dos mesmos em condições semelhantes ao ambiente alveolar foi mais lenta para a RFB em comparação com a INH, mas ambos os antibióticos apresentaram uma libertação completa ao fim de 24 horas. Em relação às características aerodinâmicas, as quais são cruciais na entrega pulmonar de fármacos, as micropartículas de KGM apresentaram diâmetros aerodinâmicos em torno dos 3 μm, independentemente das quantidades de fármaco associadas, o que evidencia a sua capacidade para atingir a zona alveolar. Além disso, a forma esférica e o tamanho geométrico de aproximadamente 2 μm apresentados pelas micropartículas de KGM demonstraram ser adequados para a sua internalização pelos macrófagos, conforme demonstrado no ensaio in vitro. Aproximadamente 100% das células THP-1 diferenciadas em macrófagos fagocitaram as micropartículas de KGM. Contudo, apesar da internalização demonstrada, não foi observada a ativação dos macrófagos após a sua exposição às micropartículas. Como mencionado anteriormente, uma limitação relevante na administração pulmonar de fármacos é a escassez de excipientes aprovados para inalação. Uma das principais razões é o destino desconhecido dos materiais após a sua deposição nos pulmões. Neste trabalho, o inchamento das micropartículas de KGM (sem antibióticos) foi observado (40% - 50%) após o contato com uma solução, mas a redução do seu tamanho (> 62% em 90 min) na presença de β-manosidase, uma enzima presente nos pulmões, foi demonstrada posteriormente, indicando uma possível biodegradabilidade após inalação. A atividade antibacteriana dos fármacos após a sua atomização foi preservada em Mycobacterium bovis, o que indicou que o processo de microencapsulação não teve qualquer interferência negativa na atividade da INH e da RFB. A concentração mínima inibitória (CMI) foi semelhante àquela determinada para os fármacos não associados às micropartículas de KGM. No entanto, um estudo preliminar indicou que as quantidades de fármaco correspondente à CMI não foram suficientes para matar as bactérias após a infeção dos macrófagos (células THP-1 diferenciadas em macrófagos) com M. bovis. O número de bactérias sobreviventes nos macrófagos diminuiu apenas ao nono dia de infeção. Além disso, a exposição continuada das bactérias às micropartículas de KGM por 7 dias indicou o desenvolvimento de um certo grau de resistência da micobactéria. Finalmente, o perfil toxicológico das micropartículas de KGM foi avaliado in vitro e in vivo. Em relação aos ensaios in vitro, estes foram focados na avaliação do perfil toxicológico em células respiratórias (epitélio alveolar e macrófagos). Apesar de terem sido avaliadas várias concentrações de forma a ter um conhecimento mais abrangente sobre o efeito do material e das micropartículas desenvolvidas, nas concentrações que se espera serem mais realistas em abordagens de entrega pulmonar (até 125 μg/mL) as micropartículas de KGM com os antibióticos não induziram um efeito de toxicidade celular evidente. O ensaio in vivo teve como foco avaliar a toxicidade do próprio material, uma vez que não está aprovado para aplicações de administração pulmonar. Os ratinhos que receberam uma administração diária das micropartículas de KGM sem fármacos por inalação por um período de duas semanas não mostraram sinais de resposta inflamatória sistémica ou pulmonar, o que está em concordância com os resultados obtidos no ensaio da ativação dos macrófagos in vitro. Além disso, a análise histológica dos pulmões não relevou diferenças após inalação comparativamente com o grupo controlo naïve, embora algumas observações inesperadas transversais a todos os grupos precisam ser clarificadas. Os resultados demonstraram ainda o desenvolvimento de eosinofilia, tipicamente associada a reações alérgicas. No entanto, não foram observadas alterações dos níveis séricos de IgE após a inalação das micropartículas de KGM, o qual se opõe ao efeito eosinofílico. No geral, apesar de algumas indicações positivas, os regulamentos sobre a avaliação de segurança de materiais incluem um grande número de parâmetros a analisar e são necessários mais estudos para aprofundar esta avaliação de forma a garantir a segurança no uso do KGM para aplicações de administração pulmonar. O conjunto de dados obtidos ao longo do trabalho deu indicações encorajadoras sobre o potencial do KGM para ser usado como um excipiente farmacêutico na formulação de transportadores de fármacos tuberculostáticos inaláveis para o tratamento da tuberculose pulmonar e, potencialmente, noutras aplicações que beneficiarão da veiculação para os macrófagos.
A tuberculose continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo.1 A terapia convencional desta infeção baseia-se na administração oral de uma combinação de vários fármacos tuberculostáticos por um período de tempo que pode alcançar os 2 anos.2 O tratamento prolongado da tuberculose tem limitado a sua terapêutica, pois favorece a não adesão do paciente ao tratamento e, consequentemente, o aparecimento de resistência aos antibióticos.3 Desta forma, é necessário o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento da tuberculose com o objetivo de ultrapassar as limitações do tratamento atual. Considerando que 80% dos casos são de tuberculose pulmonar, a administração direta de fármacos tuberculostáticos nos pulmões tem sido explorada nos últimos anos como uma alternativa terapêutica. Acredita-se que esta abordagem permitirá diminuir a dose e a frequência de administração dos antibióticos, enquanto reduz a duração do tratamento e os possíveis efeitos sistémicos associados à terapia convencional da tuberculose.4 O sucesso desta abordagem depende da engenharia de transportadores com características adequadas, os quais devem chegar à região alveolar, onde os macrófagos infetados com Mycobacterium tuberculosis estão localizados, e serem internalizados por estas células.5 Por outro lado, recetores específicos presentes na superfície dos macrófagos podem ser usados como alvos terapêuticos para a entrega dos fármacos, uma estratégia na qual os transportadores têm novamente uma função relevante. Neste momento, existem poucos excipientes aprovados para aplicações na entrega pulmonar de fármacos, o que dificulta o desenvolvimento dos transportadores.6 O trabalho desenvolvido nesta tese de doutoramento propõe o desenvolvimento de micropartículas inaláveis à base de glucomanano de konjac (KGM) direcionadas para os macrófagos alveolares. O KGM é um polissacarídeo composto por unidades de manose e glucose.7 Esta abordagem foca-se na presença de manose nas micropartículas de KGM, a qual poderá mediar um reconhecimento preferencial pelos recetores de manose presentes na superfície dos macrófagos alveolares e potenciar a sua fagocitose através destes.8 As micropartículas inaláveis foram produzidas na forma de pós secos por uma técnica de secagem por pulverização, a atomização. Para que o KGM tivesse as propriedades adequadas para a produção de micropartículas por meio desta técnica, o polímero foi inicialmente submetido a uma hidrólise ácida, a qual demonstrou não afetar as suas características físico-químicas (composição e ratio glucose/manose) e permitiu a sua atomização para a produção das micropartículas. A isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB), dois fármacos tuberculostáticos de primeira linha usados na clínica da tuberculose, foram associadas às micropartículas de KGM como fármacos modelo. Várias formulações de micropartículas de KGM com os dois antibióticos foram produzidas (KGM/INH/RFB = 10/1/0,5, 10/1/1, 10/2/0,5, m/m) e posteriormente caracterizadas. A eficácia de associação dos fármacos variou entre 66% e 91%, e a libertação dos mesmos em condições semelhantes ao ambiente alveolar foi mais lenta para a RFB em comparação com a INH, mas ambos os antibióticos apresentaram uma libertação completa ao fim de 24 horas. Em relação às características aerodinâmicas, as quais são cruciais na entrega pulmonar de fármacos, as micropartículas de KGM apresentaram diâmetros aerodinâmicos em torno dos 3 μm, independentemente das quantidades de fármaco associadas, o que evidencia a sua capacidade para atingir a zona alveolar. Além disso, a forma esférica e o tamanho geométrico de aproximadamente 2 μm apresentados pelas micropartículas de KGM demonstraram ser adequados para a sua internalização pelos macrófagos, conforme demonstrado no ensaio in vitro. Aproximadamente 100% das células THP-1 diferenciadas em macrófagos fagocitaram as micropartículas de KGM. Contudo, apesar da internalização demonstrada, não foi observada a ativação dos macrófagos após a sua exposição às micropartículas. Como mencionado anteriormente, uma limitação relevante na administração pulmonar de fármacos é a escassez de excipientes aprovados para inalação. Uma das principais razões é o destino desconhecido dos materiais após a sua deposição nos pulmões. Neste trabalho, o inchamento das micropartículas de KGM (sem antibióticos) foi observado (40% - 50%) após o contato com uma solução, mas a redução do seu tamanho (> 62% em 90 min) na presença de β-manosidase, uma enzima presente nos pulmões, foi demonstrada posteriormente, indicando uma possível biodegradabilidade após inalação. A atividade antibacteriana dos fármacos após a sua atomização foi preservada em Mycobacterium bovis, o que indicou que o processo de microencapsulação não teve qualquer interferência negativa na atividade da INH e da RFB. A concentração mínima inibitória (CMI) foi semelhante àquela determinada para os fármacos não associados às micropartículas de KGM. No entanto, um estudo preliminar indicou que as quantidades de fármaco correspondente à CMI não foram suficientes para matar as bactérias após a infeção dos macrófagos (células THP-1 diferenciadas em macrófagos) com M. bovis. O número de bactérias sobreviventes nos macrófagos diminuiu apenas ao nono dia de infeção. Além disso, a exposição continuada das bactérias às micropartículas de KGM por 7 dias indicou o desenvolvimento de um certo grau de resistência da micobactéria. Finalmente, o perfil toxicológico das micropartículas de KGM foi avaliado in vitro e in vivo. Em relação aos ensaios in vitro, estes foram focados na avaliação do perfil toxicológico em células respiratórias (epitélio alveolar e macrófagos). Apesar de terem sido avaliadas várias concentrações de forma a ter um conhecimento mais abrangente sobre o efeito do material e das micropartículas desenvolvidas, nas concentrações que se espera serem mais realistas em abordagens de entrega pulmonar (até 125 μg/mL) as micropartículas de KGM com os antibióticos não induziram um efeito de toxicidade celular evidente. O ensaio in vivo teve como foco avaliar a toxicidade do próprio material, uma vez que não está aprovado para aplicações de administração pulmonar. Os ratinhos que receberam uma administração diária das micropartículas de KGM sem fármacos por inalação por um período de duas semanas não mostraram sinais de resposta inflamatória sistémica ou pulmonar, o que está em concordância com os resultados obtidos no ensaio da ativação dos macrófagos in vitro. Além disso, a análise histológica dos pulmões não relevou diferenças após inalação comparativamente com o grupo controlo naïve, embora algumas observações inesperadas transversais a todos os grupos precisam ser clarificadas. Os resultados demonstraram ainda o desenvolvimento de eosinofilia, tipicamente associada a reações alérgicas. No entanto, não foram observadas alterações dos níveis séricos de IgE após a inalação das micropartículas de KGM, o qual se opõe ao efeito eosinofílico. No geral, apesar de algumas indicações positivas, os regulamentos sobre a avaliação de segurança de materiais incluem um grande número de parâmetros a analisar e são necessários mais estudos para aprofundar esta avaliação de forma a garantir a segurança no uso do KGM para aplicações de administração pulmonar. O conjunto de dados obtidos ao longo do trabalho deu indicações encorajadoras sobre o potencial do KGM para ser usado como um excipiente farmacêutico na formulação de transportadores de fármacos tuberculostáticos inaláveis para o tratamento da tuberculose pulmonar e, potencialmente, noutras aplicações que beneficiarão da veiculação para os macrófagos.
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Keywords
Alveolar macrophages Inhalable microparticles Isoniazid Konjac glucomannan Pulmonary drug delivery Rifabutin Spray-drying Tuberculosis