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Publication
Cryopreservation as a tool for preserving genetic variability of endangered species endemic from Algarve region
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
This thesis aims the development of complementary conservation strategies based on
plant biotechnology to support the preservation of three rare endemic species of the
Algarve, Portugal. The species studied were Thymus lotocephalus G. López & R.
Morales, Plantago algarbiensis Samp. and Tuberaria major (Willk.) P. Silva &
Rozeira. An in vitro propagation protocol was firstly developed for T. lotocephalus
using seedlings as explants (Chapter 2.1). The germination conditions and feasibility of
cryopreservation was also studied for T. lotocephalus seeds (Chapter 2.2). In Chapter
2.3 a shoot tip cryopreservation protocol was developed for this species and the genetic
stability of the cryopreserved material was assessed. For P. algarbiensis, the work was
initiated with the cryopreservation of seeds and nodal segments (Chapter 3.1), followed
by the study of the genetic diversity of three wild populations (Chapter 3.2). Chapter 4.1
was dedicated to the improvement of the germination and cryopreservation of T. major
seeds and the development of a shoot tip cryopreservation protocol.
An efficient micropropagation protocol was established for the mass production of T.
lotocephalus (Chapter 2.1) and the seeds germination requirements were determined
(Chapter 2.2). From the shoots produced in vitro, apices were excised and used in the
development of a shoot tip cryopreservation protocol (Chapter 2.2). P. algarbiensis
nodal segments were successfully cryopreserved using two different methods (Chapter
3.1). The structure of P. algarbiensis populations was effectively evaluated using
molecular markers, revealing high levels of genetic diversity within populations
(Chapter 3.2). Cryopreservation proved to be a suitable method for the conservation of
seeds from both species (Chapters 2.2 and 3.1). Finally, the germination conditions and
cryopreservation of T. major seeds were considerably improved and the
cryopreservation of T. major shoot tips was accomplished without major optimizations
of the different procedures (Chapter 4.1).
In conclusion, during the course of this thesis different ex situ conservation strategies
were developed giving a major contribution to the preservation of T. lotocephalus, P.
algarbiensis and T. major.
A biodiversidade está em risco um pouco por todo o planeta e as plantas não são exceção. As plantas são um elemento fundamental em qualquer ecossistema e os recursos fitogenéticos são a base da alimentação, para além de serem muito importantes em diversas atividades humanas. Vários fatores têm contribuído para a erosão das populações naturais e consequentemente dos recursos fitogenéticos, mas a principal causa é o desenvolvimento levado a cabo pelo Homem. Recentemente tem aumentado a preocupação e a promoção para a implementação de medidas que contribuam para a conservação dos recursos fitogenéticos. Contudo, ainda existe muito trabalho a fazer e todos os esforços são essenciais. De forma a manter o maior nível possível de diversidade genética de uma dada espécie, é importante existirem várias medidas de conservação que se complementem entre si. A conservação de biodiversidade pode ser dividida em duas grandes estratégias: in situ e ex situ. A conservação in situ refere-se à conservação da biodiversidade no seu habitat natural; enquanto a conservação ex situ consiste na conservação de biodiversidade fora do seu habitat natural, o que implica a colheita e armazenamento de material. Dentro destas estratégias, é importante referir a importância da biotecnologia no desenvolvimento de novas abordagens de conservação. A biotecnologia tem permitido desenvolver técnicas que em muito contribuem para a preservação de espécies: propagação in vitro, criopreservação, análises moleculares e marcadores moleculares. Neste estudo foram escolhidas três espécies endémicas do Algarve, Portugal, para desenvolver estratégias de conservação ex situ, devido à sua vulnerabilidade e risco de extinção: Thymus lotocephalus G. López & R. Morales, Plantago algarbiensis Samp. e Tuberaria major (Willk.) P. Silva & Rozeira. Estas espécies estão legalmente protegidas por leis portuguesas e comunitárias, no entanto medidas adicionais são necessárias para sustentar a preservação destas três espécies raras. O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de estratégias complementares para a preservação destas espécies baseadas em técnicas de biotecnologia vegetal. O primeiro passo foi o desenvolvimento de um protocolo de propagação in vitro para T. lotocephalus usando sementes como explante inicial (Capítulo 2.1). Para testar a capacidade de proliferação dos rebentos, foram testadas diferentes concentrações de meio Murashige and Skoog (MS), diferentes tipos e concentrações de citocininas e diferentes combinações de citocininas/auxinas. A capacidade de proliferação dos rebentos foi de 100% em todos os meios testados. Embora os melhores resultados de proliferação tenham sido obtidos em meios suplementados com 6-benziladenina (BA), também se observaram elevadas percentagens de rebentos hiperhídricos e estes eram significativamente mais pequenos do que os produzidos em meio sem citocininas. Desta forma, o meio escolhido para a proliferação foi MS sem reguladores de crescimento, no qual se obteve elevada proliferação de rebentos saudáveis e com um comprimento considerável. No que respeita ao enraizamento, foi necessária uma fase suplementar para o induzir. Os melhores resultados foram obtidos em meio MS sem auxinas (92,00 ± 6,11%, 6,54 ± 0,52 e 1,60 ± 0,10 cm para frequência de enraizamento, numero de raízes por rebento e raiz mais comprida, respetivamente) ou suplementado com 0,5 mg l-1 3- indole ácido acético (98,00 ± 2,11%, 11,14 ± 0,75 e 2,40 ± 0,24 cm, respetivamente). As plântulas obtidas foram aclimatizadas com sucesso às condições ex vitro com uma percentagem de sobrevivência de 93,33%. Seguiu-se o estudo dos requisitos de germinação e da tolerância à criopreservação de sementes de T. lotocephalus colhidas de quatro populações (Algoz, Tunes, Belharucas e Gambelas) (Capítulo 2.2). As sementes foram colocadas a germinar a 15 e 25ºC com um fotoperíodo de 16/8 h luz/escuro ou escuro constante. Verificou-se que a melhor temperatura de germinação foi 15ºC, tanto na presença como na ausência de luz, com percentagens de germinação acima dos 80% e tempos médios de germinação inferiores a 10 dias. As sementes foram por isso consideradas não dormentes. Também se observaram poucas diferenças nos resultados entre sementes de diferentes populações. Para avaliar a sua tolerância à criopreservação, as sementes foram imersas diretamente em azoto líquido durante 30 dias, tendo-se concluído que as baixas temperaturas do azoto líquido não prejudicaram a germinação de sementes de T. lotocephalus. Também foi desenvolvido um protocolo de criopreservação de ápices de T. lotocephalus no Capítulo 2.3. Foram testados três métodos diferentes, vitrificaçãodroplet, vitrificação e encapsulação-desidratação, sendo o primeiro aquele que apresentou os melhores resultados. As diferentes fases e condições de cada método foram posteriormente otimizadas, obtendo-se uma percentagem de recuperação de ápices criopreservados de 67%. Essas condições foram: quatro semanas de subcultura das plantas dadoras in vitro a 25ºC, um dia de pré-cultura em meio MS suplementado com 0,3 M de sacarose dos ápices excisados, tratamento de 60 min em PVS2 (“plant vitrification solution 2”) e meio MS suplementado com 0,2 de mg l-1 de zeatina como meio de recuperação. A estabilidade genética dos ápices criopreservados foi também avaliada usando marcadores RAPD (“random amplified polymorphic DNA”). Não se observaram variações significantes apresentando os rebentos regenerados a partir de ápices criopreservados um desenvolvimento normal quando comparados com os rebentos in vitro que não sujeitos à criopreservação. No caso de P. algarbiensis, como já existia um protocolo de propagação in vitro e já havia sido realizado o estudo dos requisitos de germinação, o trabalho incidiu na criopreservação de sementes e segmentos nodais (Capítulo 3.1). Verificou-se que a criopreservação de sementes não afetou negativamente a sua germinação e que este é um método viável para a conservação de material vegetal desta espécie. Os métodos testados na criopreservação de segmentos nodais, vitrificação-droplet e encapsulaçãodesidratação, apresentaram percentagens de recuperação de 60,0 ± 15,2% e de 63,3 ± 9,6%, respetivamente. Estes resultados foram obtidos após 120 min de exposição à PVS2, com o método vitrificação-droplet, e após 3 h de dessecação, com o método encapsulação-desidratação. Para ambos os casos, os segmentos nodais foram précultivados em meio MS e, depois de criopreservados, foram cultivados em meio MS suplementado com 0,2 mg l-1 BA para recuperar. No capítulo 3.2, foi avaliada a diversidade genética de três populações selvagens de P. algarbiensis (Algoz, Tunes and Gambelas), usando marcadores RAPD. As amostras foram amplificadas com o recurso a 10 primers que geraram 145 marcadores, dos quais 80% eram polimórficos. Foram detetados elevados níveis de polimorfismo e a população de Tunes foi a que apresentou a percentagem de polimorfismo mais elevada (73,68%). Na análise de cluster, os indivíduos das populações de Tunes e Algoz agruparam-se juntos, formando um grupo, e os de Gambelas agruparam-se num grupo separado, o que está de acordo com as suas localizações geográficas. De acordo com os valores estimados tanto pelo índice de diversidade genética de Nei como pela medida de informação de Shannon, os níveis mais elevados de diversidade genética foram encontrados na população de Tunes e os mais baixos na população de Algoz. Valores semelhantes foram obtidos a partir do índice de Shannon e da análise AMOVA: a proporção de diversidade dentro das populações foi mais elevada do que entre populações, aproximadamente 86 e 14%, respetivamente. Foi estabelecida uma correlação entre distâncias geográficas e genéticas entre populações e o nível de fluxo genético entre populações foi elevado e inversamente proporcional à distância entre populações. Por fim, para T. major, como também já havia sido estabelecido um protocolo de propagação in vitro, o estudo focou-se no desenvolvimento de um protocolo de criopreservação de ápices, tendo-se testado os métodos vitrificação-droplet, vitrificação e encapsulação-desidratação (Capítulo 4.1). As percentagens de recuperação mais elevadas, 60 e 65%, foram obtidas usando os métodos vitrificação, após 60 min de exposição à PVS2, e encapsulação-desidratação, após 3 h de dessecação, respetivamente. Com o método vitrificação-droplet, obtiveram-se percentagens de recuperação abaixo dos 40%. Os requisitos de germinação e a criopreservação de sementes de T. major também já tinham sido anteriormente estudados, embora as percentagens finais de germinação tenham sido relativamente baixas. Por esta razão, neste trabalho foi também investigado no Capítulo 4.1 como melhorar as condições de germinação e consequentemente a criopreservação de sementes. Verificou-se que a percentagem de germinação melhorou consideravelmente ao efetuar um pré-tratamento de escarificação das sementes (aproximadamente 95%), quando comparado com o pré-tratamento previamente usado, calor seco (aproximadamente 65%). Por conseguinte, a percentagem de germinação de sementes após criopreservação também foi melhorada, não sofrendo qualquer variação em relação à de sementes não criopreservadas. Durante o presente trabalho foram conseguidas diversas abordagens viáveis que irão apoiar a conservação ex situ de T. lotocephalus, P. algarbiensis e T. major. Os protocolos desenvolvidos neste estudo, assim como outros anteriormente descritos, irão complementar a proteção legal de que todas estas espécies já possuem. Todas estas estratégias juntamente com uma apropriada gestão poderão prevenir e evitar a extinção destas espécies. Este trabalho é um contributo importante para a conservação de espécies endémicas em perigo.
A biodiversidade está em risco um pouco por todo o planeta e as plantas não são exceção. As plantas são um elemento fundamental em qualquer ecossistema e os recursos fitogenéticos são a base da alimentação, para além de serem muito importantes em diversas atividades humanas. Vários fatores têm contribuído para a erosão das populações naturais e consequentemente dos recursos fitogenéticos, mas a principal causa é o desenvolvimento levado a cabo pelo Homem. Recentemente tem aumentado a preocupação e a promoção para a implementação de medidas que contribuam para a conservação dos recursos fitogenéticos. Contudo, ainda existe muito trabalho a fazer e todos os esforços são essenciais. De forma a manter o maior nível possível de diversidade genética de uma dada espécie, é importante existirem várias medidas de conservação que se complementem entre si. A conservação de biodiversidade pode ser dividida em duas grandes estratégias: in situ e ex situ. A conservação in situ refere-se à conservação da biodiversidade no seu habitat natural; enquanto a conservação ex situ consiste na conservação de biodiversidade fora do seu habitat natural, o que implica a colheita e armazenamento de material. Dentro destas estratégias, é importante referir a importância da biotecnologia no desenvolvimento de novas abordagens de conservação. A biotecnologia tem permitido desenvolver técnicas que em muito contribuem para a preservação de espécies: propagação in vitro, criopreservação, análises moleculares e marcadores moleculares. Neste estudo foram escolhidas três espécies endémicas do Algarve, Portugal, para desenvolver estratégias de conservação ex situ, devido à sua vulnerabilidade e risco de extinção: Thymus lotocephalus G. López & R. Morales, Plantago algarbiensis Samp. e Tuberaria major (Willk.) P. Silva & Rozeira. Estas espécies estão legalmente protegidas por leis portuguesas e comunitárias, no entanto medidas adicionais são necessárias para sustentar a preservação destas três espécies raras. O principal objetivo deste trabalho é o desenvolvimento de estratégias complementares para a preservação destas espécies baseadas em técnicas de biotecnologia vegetal. O primeiro passo foi o desenvolvimento de um protocolo de propagação in vitro para T. lotocephalus usando sementes como explante inicial (Capítulo 2.1). Para testar a capacidade de proliferação dos rebentos, foram testadas diferentes concentrações de meio Murashige and Skoog (MS), diferentes tipos e concentrações de citocininas e diferentes combinações de citocininas/auxinas. A capacidade de proliferação dos rebentos foi de 100% em todos os meios testados. Embora os melhores resultados de proliferação tenham sido obtidos em meios suplementados com 6-benziladenina (BA), também se observaram elevadas percentagens de rebentos hiperhídricos e estes eram significativamente mais pequenos do que os produzidos em meio sem citocininas. Desta forma, o meio escolhido para a proliferação foi MS sem reguladores de crescimento, no qual se obteve elevada proliferação de rebentos saudáveis e com um comprimento considerável. No que respeita ao enraizamento, foi necessária uma fase suplementar para o induzir. Os melhores resultados foram obtidos em meio MS sem auxinas (92,00 ± 6,11%, 6,54 ± 0,52 e 1,60 ± 0,10 cm para frequência de enraizamento, numero de raízes por rebento e raiz mais comprida, respetivamente) ou suplementado com 0,5 mg l-1 3- indole ácido acético (98,00 ± 2,11%, 11,14 ± 0,75 e 2,40 ± 0,24 cm, respetivamente). As plântulas obtidas foram aclimatizadas com sucesso às condições ex vitro com uma percentagem de sobrevivência de 93,33%. Seguiu-se o estudo dos requisitos de germinação e da tolerância à criopreservação de sementes de T. lotocephalus colhidas de quatro populações (Algoz, Tunes, Belharucas e Gambelas) (Capítulo 2.2). As sementes foram colocadas a germinar a 15 e 25ºC com um fotoperíodo de 16/8 h luz/escuro ou escuro constante. Verificou-se que a melhor temperatura de germinação foi 15ºC, tanto na presença como na ausência de luz, com percentagens de germinação acima dos 80% e tempos médios de germinação inferiores a 10 dias. As sementes foram por isso consideradas não dormentes. Também se observaram poucas diferenças nos resultados entre sementes de diferentes populações. Para avaliar a sua tolerância à criopreservação, as sementes foram imersas diretamente em azoto líquido durante 30 dias, tendo-se concluído que as baixas temperaturas do azoto líquido não prejudicaram a germinação de sementes de T. lotocephalus. Também foi desenvolvido um protocolo de criopreservação de ápices de T. lotocephalus no Capítulo 2.3. Foram testados três métodos diferentes, vitrificaçãodroplet, vitrificação e encapsulação-desidratação, sendo o primeiro aquele que apresentou os melhores resultados. As diferentes fases e condições de cada método foram posteriormente otimizadas, obtendo-se uma percentagem de recuperação de ápices criopreservados de 67%. Essas condições foram: quatro semanas de subcultura das plantas dadoras in vitro a 25ºC, um dia de pré-cultura em meio MS suplementado com 0,3 M de sacarose dos ápices excisados, tratamento de 60 min em PVS2 (“plant vitrification solution 2”) e meio MS suplementado com 0,2 de mg l-1 de zeatina como meio de recuperação. A estabilidade genética dos ápices criopreservados foi também avaliada usando marcadores RAPD (“random amplified polymorphic DNA”). Não se observaram variações significantes apresentando os rebentos regenerados a partir de ápices criopreservados um desenvolvimento normal quando comparados com os rebentos in vitro que não sujeitos à criopreservação. No caso de P. algarbiensis, como já existia um protocolo de propagação in vitro e já havia sido realizado o estudo dos requisitos de germinação, o trabalho incidiu na criopreservação de sementes e segmentos nodais (Capítulo 3.1). Verificou-se que a criopreservação de sementes não afetou negativamente a sua germinação e que este é um método viável para a conservação de material vegetal desta espécie. Os métodos testados na criopreservação de segmentos nodais, vitrificação-droplet e encapsulaçãodesidratação, apresentaram percentagens de recuperação de 60,0 ± 15,2% e de 63,3 ± 9,6%, respetivamente. Estes resultados foram obtidos após 120 min de exposição à PVS2, com o método vitrificação-droplet, e após 3 h de dessecação, com o método encapsulação-desidratação. Para ambos os casos, os segmentos nodais foram précultivados em meio MS e, depois de criopreservados, foram cultivados em meio MS suplementado com 0,2 mg l-1 BA para recuperar. No capítulo 3.2, foi avaliada a diversidade genética de três populações selvagens de P. algarbiensis (Algoz, Tunes and Gambelas), usando marcadores RAPD. As amostras foram amplificadas com o recurso a 10 primers que geraram 145 marcadores, dos quais 80% eram polimórficos. Foram detetados elevados níveis de polimorfismo e a população de Tunes foi a que apresentou a percentagem de polimorfismo mais elevada (73,68%). Na análise de cluster, os indivíduos das populações de Tunes e Algoz agruparam-se juntos, formando um grupo, e os de Gambelas agruparam-se num grupo separado, o que está de acordo com as suas localizações geográficas. De acordo com os valores estimados tanto pelo índice de diversidade genética de Nei como pela medida de informação de Shannon, os níveis mais elevados de diversidade genética foram encontrados na população de Tunes e os mais baixos na população de Algoz. Valores semelhantes foram obtidos a partir do índice de Shannon e da análise AMOVA: a proporção de diversidade dentro das populações foi mais elevada do que entre populações, aproximadamente 86 e 14%, respetivamente. Foi estabelecida uma correlação entre distâncias geográficas e genéticas entre populações e o nível de fluxo genético entre populações foi elevado e inversamente proporcional à distância entre populações. Por fim, para T. major, como também já havia sido estabelecido um protocolo de propagação in vitro, o estudo focou-se no desenvolvimento de um protocolo de criopreservação de ápices, tendo-se testado os métodos vitrificação-droplet, vitrificação e encapsulação-desidratação (Capítulo 4.1). As percentagens de recuperação mais elevadas, 60 e 65%, foram obtidas usando os métodos vitrificação, após 60 min de exposição à PVS2, e encapsulação-desidratação, após 3 h de dessecação, respetivamente. Com o método vitrificação-droplet, obtiveram-se percentagens de recuperação abaixo dos 40%. Os requisitos de germinação e a criopreservação de sementes de T. major também já tinham sido anteriormente estudados, embora as percentagens finais de germinação tenham sido relativamente baixas. Por esta razão, neste trabalho foi também investigado no Capítulo 4.1 como melhorar as condições de germinação e consequentemente a criopreservação de sementes. Verificou-se que a percentagem de germinação melhorou consideravelmente ao efetuar um pré-tratamento de escarificação das sementes (aproximadamente 95%), quando comparado com o pré-tratamento previamente usado, calor seco (aproximadamente 65%). Por conseguinte, a percentagem de germinação de sementes após criopreservação também foi melhorada, não sofrendo qualquer variação em relação à de sementes não criopreservadas. Durante o presente trabalho foram conseguidas diversas abordagens viáveis que irão apoiar a conservação ex situ de T. lotocephalus, P. algarbiensis e T. major. Os protocolos desenvolvidos neste estudo, assim como outros anteriormente descritos, irão complementar a proteção legal de que todas estas espécies já possuem. Todas estas estratégias juntamente com uma apropriada gestão poderão prevenir e evitar a extinção destas espécies. Este trabalho é um contributo importante para a conservação de espécies endémicas em perigo.
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Keywords
Biotecnologia Conservação in vitro Técnicas Marcadores moleculares