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Somitogenesis is a critical process in early vertebrate development, leading to the periodic formation of somites from the presomitic mesoderm (PSM) along the rostral-caudal axis during body elongation. These somites, which serve as embryonic precursors to the axial skeleton, are crucial for the proper development of vertebrae and other segmented structures. While the periodicity of somite formation can vary significantly between species, it remains highly constant within each species. This periodicity is driven by the embryo clock (EC), an intrinsic mechanism in PSM cells that relies on oscillations of gene expression, regulated through negative feedback loops, requiring short-lived mRNA transcripts. The stability of these transcripts is influenced by regulatory regions (RR) within the mRNA 3’ Untranslated Region (3’UTR). Proper somite formation requires synchronization between PSM cells, facilitated by Notch-Delta signaling, which coordinates cellular division and differentiation. This work investigated the role of the 3’UTR of the zebrafish deltaC clock gene in somite formation periodicity. Various zebrafish mutant lines were generated using CRISPR/Cas9. A previously generated mutant line (RR2) was characterized, assessing somite number, size, periodicity of formation, as well as the expression of EC genes. The comparison between the RR2 mutant and wildtype embryos showed no differences in somite size or number. Also, deltaC and her7 clock gene expression were unaltered. However, the RR2 mutant showed a slight decrease in the periodicity of somite formation. In conclusion, this work describes new animal model systems to study the embryo clock and provided new data on the importance of deltaC mRNA 3’UTR for somite formation.
A somitogénese é um processo crítico no desenvolvimento inicial dos vertebrados, levando à formação periódica de somitos a partir da mesoderme pré-somítica (PSM) ao longo do eixo rostral-caudal, durante o elongamento corporal. Esses sómitos, que atuam como precursores embrionários do esqueleto axial, são essenciais para o desenvolvimento adequado das vértebras e outras estruturas segmentadas. Embora a periodicidade da formação dos sómitos possa variar significativamente entre espécies, ela permanece constante dentro de cada espécie. Essa periodicidade é controlada pelo relógio embrionário, um mecanismo intrínseco nas células da PSM que depende das oscilações da expressão génica, reguladas por circuitos de feedback negativo, que requerem transcritos de mRNA de curta duração. A estabilidade desses transcritos é influenciada por regiões reguladoras (RR) na região 3' não traduzida (3'UTR) do mRNA. A formação adequada dos sómitos requer a sincronização entre as células do PSM, facilitada pela sinalização Notch-Delta, que coordena a divisão e diferenciação celular. Este trabalho investigou o papel da região 3'UTR do mRNA gene do relógio deltaC no peixe-zebra na periodicidade da formação dos sómitos. Diversas linhas mutantes de peixe-zebra foram geradas de novo usando a metodologia CRISPR/Cas9. O objetivo foi recriar duas linhas mutantes: deltaC RR3 e deltaC RR2&3, com deleções em diferentes regiões da 3'UTR do deltaC. Embora a tentativa de recriar a linha RR3 tenha falhado, foi possível recriar a linha RR2&3. A nova linha RR2&3 carrega uma deleção que abrange ambas as regiões reguladoras 2 e 3 da 3'UTR do deltaC. Além da geração de novas mutações, a linha mutante RR2 previamente estabelecida foi caracterizada para estudar os efeitos dessa deleção específica na somitogénese. Uma linha mutante previamente gerado (RR2) foi caracterizado, avaliando o número de sómitos, tamanho, periodicidade de formação e a expressão dos genes do relógio em embriões. A análise da linha RR2 não mostrou diferenças na morfologia dos sómitos e na expressão dos genes do relógio, mas apresentou um leve atraso na formação dos sómitos. Para analisar a somitogénese nesses mutantes, foi realizada hibridização in situ em embriões inteiros, utilizando uma sonda para a marcação específica dos limites dos somitos, o que permitiu uma visualização clara da sua morfologia. Isso envolveu a comparação direta de embriões resultantes de cruzamentos entre pais heterozigotos RR2, obtendo uma mistura de descendentes do tipo selvagem, mutantes heterozigotos e mutantes homozigotos. Após a análise dos somitos #9-12 e #20-23 desses embriões, eles foram individualmente genotipados por gel de agarose. Essa genotipagem permitiu que os resultados fossem específicos para cada grupo de mutação. Não foram encontradas diferenças significativas no número ou comprimento dos somitos entre embriões do tipo selvagem e mutantes heterozigotos ou homozigotos RR2. Isso indica que a deleção da RR2 não interrompe os aspetos morfológicos da formação dos sómitos. Para investigar se a deleção da RR2 afeta o tempo de formação dos somitos, foram realizadas imagens ao vivo de embriões resultantes de cruzamentos entre pais heterozigotos RR2. Isso envolveu embriões no início do desenvolvimento, cujo córion foi removido e que foram posicionados lateralmente em um meio viscoso de metilcelulose, restringindo o movimento durante a captura de imagens ao vivo. A adição de uma baixa concentração de um relaxante muscular minimizou ainda mais o movimento, sem prejudicar o desenvolvimento natural. Em seguida, esses embriões foram fotografados por microscópio, capturando imagens a cada minuto, que foram usadas para criar vídeos time-lapse da formação dos somitos. A análise desses time-lapses, focada no tempo necessário para a formação dos somitos #9-12 e #20-23, revelou que os mutantes homozigotos RR2 mostraram um aumento estatisticamente significativo no tempo necessário para a formação de somitos anteriores e posteriores, em comparação com embriões do tipo selvagem, enquanto os heterozigotos apresentaram um aumento leve, mas não estatisticamente significativo. Para investigar os efeitos da mutação RR2 no nível molecular, foi utilizada a técnica de hibridização in situ para observar o impacto na expressão de dois genes-chave do relógio embrionário, deltaC e her7, em embriões inteiros no início do desenvolvimento. Embriões de cruzamentos heterozigotos RR2 com 12 hpf e 17 hpf, pontos de tempo correspondentes aos estágios em que os somitos #9-12 e #20-23 são formados, respetivamente, foram analisados. Após a hibridização com sondas direcionadas ao mRNA de deltaC e her7, não foram encontradas diferenças significativas nos padrões de expressão desses genes entre embriões do tipo selvagem, heterozigotos e mutantes homozigotos RR2. Isso sugere que, apesar do atraso observado na formação dos somitos, a deleção RR2 não perturba radicalmente as dinâmicas de expressão desses componentes centrais do relógio embrionário. Os resultados desta pesquisa mostram que, embora a deleção RR2 na 3'UTR do deltaC não pareça afetar o desenvolvimento morfológico dos sómitos, ela resulta em um atraso estatisticamente significativo no tempo de formação dos somitos. Isso sugere que a região RR2, embora não seja essencial para a funcionalidade básica do relógio embrionário, pode desempenhar um papel na regulação do seu ritmo. Além disso, o estudo demonstra a importância das técnicas de genotipagem individual e de imagens ao vivo para descobrir variações sutis que podem não ser aparentes sem análises detalhadas. Em conclusão, este trabalho resultou na criação de novos sistemas modelo animais para o estudo do relógio embrionário e forneceu novos dados sobre a importância da região 3'UTR do mRNA de deltaC na formação dos sómitos. Pesquisas futuras devem se concentrar na caracterização dos efeitos das deleções nas mutações RR3 e RR2&3 durante a somitogénese. Além disso, uma investigação mais detalhada dos mecanismos moleculares subjacentes ao atraso na formação dos somitos em mutantes RR2 é necessária, para compreender o que levou ao abrandamento na formação de alguns sómitos.
A somitogénese é um processo crítico no desenvolvimento inicial dos vertebrados, levando à formação periódica de somitos a partir da mesoderme pré-somítica (PSM) ao longo do eixo rostral-caudal, durante o elongamento corporal. Esses sómitos, que atuam como precursores embrionários do esqueleto axial, são essenciais para o desenvolvimento adequado das vértebras e outras estruturas segmentadas. Embora a periodicidade da formação dos sómitos possa variar significativamente entre espécies, ela permanece constante dentro de cada espécie. Essa periodicidade é controlada pelo relógio embrionário, um mecanismo intrínseco nas células da PSM que depende das oscilações da expressão génica, reguladas por circuitos de feedback negativo, que requerem transcritos de mRNA de curta duração. A estabilidade desses transcritos é influenciada por regiões reguladoras (RR) na região 3' não traduzida (3'UTR) do mRNA. A formação adequada dos sómitos requer a sincronização entre as células do PSM, facilitada pela sinalização Notch-Delta, que coordena a divisão e diferenciação celular. Este trabalho investigou o papel da região 3'UTR do mRNA gene do relógio deltaC no peixe-zebra na periodicidade da formação dos sómitos. Diversas linhas mutantes de peixe-zebra foram geradas de novo usando a metodologia CRISPR/Cas9. O objetivo foi recriar duas linhas mutantes: deltaC RR3 e deltaC RR2&3, com deleções em diferentes regiões da 3'UTR do deltaC. Embora a tentativa de recriar a linha RR3 tenha falhado, foi possível recriar a linha RR2&3. A nova linha RR2&3 carrega uma deleção que abrange ambas as regiões reguladoras 2 e 3 da 3'UTR do deltaC. Além da geração de novas mutações, a linha mutante RR2 previamente estabelecida foi caracterizada para estudar os efeitos dessa deleção específica na somitogénese. Uma linha mutante previamente gerado (RR2) foi caracterizado, avaliando o número de sómitos, tamanho, periodicidade de formação e a expressão dos genes do relógio em embriões. A análise da linha RR2 não mostrou diferenças na morfologia dos sómitos e na expressão dos genes do relógio, mas apresentou um leve atraso na formação dos sómitos. Para analisar a somitogénese nesses mutantes, foi realizada hibridização in situ em embriões inteiros, utilizando uma sonda para a marcação específica dos limites dos somitos, o que permitiu uma visualização clara da sua morfologia. Isso envolveu a comparação direta de embriões resultantes de cruzamentos entre pais heterozigotos RR2, obtendo uma mistura de descendentes do tipo selvagem, mutantes heterozigotos e mutantes homozigotos. Após a análise dos somitos #9-12 e #20-23 desses embriões, eles foram individualmente genotipados por gel de agarose. Essa genotipagem permitiu que os resultados fossem específicos para cada grupo de mutação. Não foram encontradas diferenças significativas no número ou comprimento dos somitos entre embriões do tipo selvagem e mutantes heterozigotos ou homozigotos RR2. Isso indica que a deleção da RR2 não interrompe os aspetos morfológicos da formação dos sómitos. Para investigar se a deleção da RR2 afeta o tempo de formação dos somitos, foram realizadas imagens ao vivo de embriões resultantes de cruzamentos entre pais heterozigotos RR2. Isso envolveu embriões no início do desenvolvimento, cujo córion foi removido e que foram posicionados lateralmente em um meio viscoso de metilcelulose, restringindo o movimento durante a captura de imagens ao vivo. A adição de uma baixa concentração de um relaxante muscular minimizou ainda mais o movimento, sem prejudicar o desenvolvimento natural. Em seguida, esses embriões foram fotografados por microscópio, capturando imagens a cada minuto, que foram usadas para criar vídeos time-lapse da formação dos somitos. A análise desses time-lapses, focada no tempo necessário para a formação dos somitos #9-12 e #20-23, revelou que os mutantes homozigotos RR2 mostraram um aumento estatisticamente significativo no tempo necessário para a formação de somitos anteriores e posteriores, em comparação com embriões do tipo selvagem, enquanto os heterozigotos apresentaram um aumento leve, mas não estatisticamente significativo. Para investigar os efeitos da mutação RR2 no nível molecular, foi utilizada a técnica de hibridização in situ para observar o impacto na expressão de dois genes-chave do relógio embrionário, deltaC e her7, em embriões inteiros no início do desenvolvimento. Embriões de cruzamentos heterozigotos RR2 com 12 hpf e 17 hpf, pontos de tempo correspondentes aos estágios em que os somitos #9-12 e #20-23 são formados, respetivamente, foram analisados. Após a hibridização com sondas direcionadas ao mRNA de deltaC e her7, não foram encontradas diferenças significativas nos padrões de expressão desses genes entre embriões do tipo selvagem, heterozigotos e mutantes homozigotos RR2. Isso sugere que, apesar do atraso observado na formação dos somitos, a deleção RR2 não perturba radicalmente as dinâmicas de expressão desses componentes centrais do relógio embrionário. Os resultados desta pesquisa mostram que, embora a deleção RR2 na 3'UTR do deltaC não pareça afetar o desenvolvimento morfológico dos sómitos, ela resulta em um atraso estatisticamente significativo no tempo de formação dos somitos. Isso sugere que a região RR2, embora não seja essencial para a funcionalidade básica do relógio embrionário, pode desempenhar um papel na regulação do seu ritmo. Além disso, o estudo demonstra a importância das técnicas de genotipagem individual e de imagens ao vivo para descobrir variações sutis que podem não ser aparentes sem análises detalhadas. Em conclusão, este trabalho resultou na criação de novos sistemas modelo animais para o estudo do relógio embrionário e forneceu novos dados sobre a importância da região 3'UTR do mRNA de deltaC na formação dos sómitos. Pesquisas futuras devem se concentrar na caracterização dos efeitos das deleções nas mutações RR3 e RR2&3 durante a somitogénese. Além disso, uma investigação mais detalhada dos mecanismos moleculares subjacentes ao atraso na formação dos somitos em mutantes RR2 é necessária, para compreender o que levou ao abrandamento na formação de alguns sómitos.
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Deltac Peixe-zebra Mutantes Relógio embrionário Somitogénese