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Abstract(s)
The segmented signal for vertebral body development is conveyed, in zebrafish, through mineralization of the notochordal sheath and, in chicken, through resegmentation of the most medially located ventral sclerotome cells, with the contribution of the notochord still unclear. Along with the different size of the notochord in these two embryos, this leads to the hypothesis that evolutionary changes in the expression territories of transcription factors could underlie these differences. In the zebrafish axial(notochord)/paraxial(PSM/somite/sclerotome) mesoderm progenitor region, flh normally represses spt that normally defines paraxial mesoderm fate, leading to an axial mesoderm one instead.
The aims of this thesis were to clarify the role of the notochord in chicken segmented vertebral body formation and investigate the role of transcription factor evolutionary changes in this process’s differences between zebrafish and chicken. In chapter II we thoroughly describe the first morphological landmark of segmented vertebrae, Von Ebner’s fissure, using it as a proxy to observe that the notochord and dermomyotome are not responsible for vertebral body segmented signal initiation. In chapter III, through CNOT2 electroporation experiments, we observe an increase in the axial mesoderm size (notochord and floor plate), accompanied by a shortening of axial length and downregulation of TBX6L. We conclude that CNOT2 represses TBX6L, leading axial/paraxial progenitor cells to assume an axial mesoderm cell fate. In chapter IV, we fill in a lingering chicken embryo knowledge gap, by producing a detailed quantification of early axis elongation. At the same time, we provide a reproducible and precise staging system and a morphometric tool to analyze experimental data.
This thesis demonstrates the evolutionary shift in preponderance from the notochord to the PSM/somites/sclerotome in the role on segmented signal location and axial elongation. It also proposes that changes in the flh/CNOT2 and spt/TBX6L expression territories in the axial/paraxial mesoderm region are underlying these shifts.
A segmentação é uma característica comum a uma grande percentagem de animais que permite uma organização funcional e estrutural do corpo. Esta característica é particularmente evidente nos animais vertebrados que possuem um esqueleto axial formado por estruturas ósseas repetidas ao longo do eixo antero-posterior do corpo, as vértebras. Estas são compostas por um núcleo ósseo central denominado “corpo vertebral” e por arcos localizados dorsalmente e/ou ventralmente ao corpo vertebral, denominados “arcos vertebrais”. A formação do corpo vertebral é um processo muito interessante do ponto de vista da Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, já que ocorre de diferentes maneiras em diferentes grupos de animais. Geralmente, o corpo vertebral forma-se graças à contribuição de duas estruturas embrionárias, a notocorda e o sómito. A notochorda é uma estrutura embrionária axial alongada composta por células vacuolizadas no lúmen e coberta por uma bainha envolvente com células denominadas cordoblastos. Esta estrutura representa o primeiro esqueleto embrinário, tendo várias funções, estruturais e de sinalização genética. Os sómitos são esferas de células mesenquimatosas localizadas em pares, flanqueando a notocorda. Estes formam-se sequencialmente a partir da mesoderme pré-somitica, através de transições epitélio-mesênquima num processo é altamente regulado por um conjunto de genes expressos ciclicamente denominado “relógio embrionário”. Cada sómito dá origem a vários compartimentos (dependendo das espécies) que irão dar origem a diferentes tecidos: o esclerótomo que dá origem a tecidos ósseos e o miótomo que origina tecidos musculares e o dermamiótomo que origina vários tecidos como derme e músculo, entre outros. Apesar do corpo da vértebra ter uma contribuição destas duas estruturas, a importância de cada para o processo é diferente entre vários grupos de animais, sobretudo na estrutura que confere o sinal necessário para a formação de corpos vertebrais segmentados. Em peixes como o peixe-zebra, este sinal provém da mineralização da baínha da notocorda pelos cordoblastos. Em amniotas, como a galinha, este sinal começa por aparecer sob a forma de uma divisão rostro-caudal do esclerótomo em dois compartimentos. Esta padronização é mantida na formação do corpo vertebral através do processo de resegmentação. Neste, cada vértebra é formada pela junção da metade caudal de um esclerótomo com a metade rostral do esclerótomo seguinte. A fissura que separa as duas metades do esclerótomo, denominada “fissura de Von Ebner”, é então o primeiro sinal morfológico da segmentação das vértebras. Nestes animais o papel da notocorda é ainda uma incógnita, já que experiências de remoção desta estrutura resultam na formação de corpos de vértebra fundidos. Por outro lado, o tamanho da notocorda relativamente ao embrião é consideravelmente maior no embrião de peixe-zebra do que no de galinha. O contrário acontece com o esclerótomo, em que este corresponde à maior percentagem de tamanho do sómito maduro no embrião de galinha, sendo apenas uma fina linha de células no embrião de peixe-zebra. Isto leva-nos questionar que transformações poderão ter ocorrido que explicariam estas diferenças. A chave para a resposta a esta pergunta está no processo de desenvolvimento, já que, muitas vezes, as diferenças neste processo são a razão para as diferenças morfológicas observadas entre espécies. Tanto a notocorda como os sómitos provém de células da mesoderme, mais especificamente da mesoderme axial e paraxial, respectivamente. Durante o processo de desenvolvimento, existem zonas progenitoras que contém factores de transcrição, cuja expressão controla o seu destino. Mutações nestes genes podem causar transformações homeóticas, isto é, conversão das células de uma estrutura noutra diferente. Dois genes descobertos em peixe-zebra, quando mutados, causam alterações deste género: O gene flating head (flh), quando mutado, leva à transformação total da notocorda em sómito, enquanto o gene spadetail (spt) leva a uma conversão parcial de células dos sómitos em notocorda. Foi então descoberto que o flh reprime o spt em células progenitoras de notocorda, levando-as a assumir um destino de notocorda em vez de sómito. Assim sendo, os objectivos desta tese foram 1) clarificar o papel da notocorda na formação do corpo da vértebra; 2) investigar se a razão das diferenças observadas no papel da notocorda neste processo se deve à alteração nos territórios de expressão de genes como o flh ou o spt. No capítulo II procedemos ao estudo do efeito da notocorda e do dermamiótomo na segmentação do corpo da vértebra, usando para tal a fissura de Von Ebner como indicador desta segmentação. Para o fazer, começamos por descrever este marco morfológico, tendo descoberto que ele aparece em embriões a partir do sómito IX, Com este conhecimento adquirido, procedemos a experiências de remoção da notocorda e do dermomiótomo e avaliação da presença da fissura de Von Ebner. Em ambas as experiências, a fissura manteve-se inalterada, sugerindo que as duas estruturas não possuem um papel na segmentação do corpo da vértebra.(…)
A segmentação é uma característica comum a uma grande percentagem de animais que permite uma organização funcional e estrutural do corpo. Esta característica é particularmente evidente nos animais vertebrados que possuem um esqueleto axial formado por estruturas ósseas repetidas ao longo do eixo antero-posterior do corpo, as vértebras. Estas são compostas por um núcleo ósseo central denominado “corpo vertebral” e por arcos localizados dorsalmente e/ou ventralmente ao corpo vertebral, denominados “arcos vertebrais”. A formação do corpo vertebral é um processo muito interessante do ponto de vista da Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, já que ocorre de diferentes maneiras em diferentes grupos de animais. Geralmente, o corpo vertebral forma-se graças à contribuição de duas estruturas embrionárias, a notocorda e o sómito. A notochorda é uma estrutura embrionária axial alongada composta por células vacuolizadas no lúmen e coberta por uma bainha envolvente com células denominadas cordoblastos. Esta estrutura representa o primeiro esqueleto embrinário, tendo várias funções, estruturais e de sinalização genética. Os sómitos são esferas de células mesenquimatosas localizadas em pares, flanqueando a notocorda. Estes formam-se sequencialmente a partir da mesoderme pré-somitica, através de transições epitélio-mesênquima num processo é altamente regulado por um conjunto de genes expressos ciclicamente denominado “relógio embrionário”. Cada sómito dá origem a vários compartimentos (dependendo das espécies) que irão dar origem a diferentes tecidos: o esclerótomo que dá origem a tecidos ósseos e o miótomo que origina tecidos musculares e o dermamiótomo que origina vários tecidos como derme e músculo, entre outros. Apesar do corpo da vértebra ter uma contribuição destas duas estruturas, a importância de cada para o processo é diferente entre vários grupos de animais, sobretudo na estrutura que confere o sinal necessário para a formação de corpos vertebrais segmentados. Em peixes como o peixe-zebra, este sinal provém da mineralização da baínha da notocorda pelos cordoblastos. Em amniotas, como a galinha, este sinal começa por aparecer sob a forma de uma divisão rostro-caudal do esclerótomo em dois compartimentos. Esta padronização é mantida na formação do corpo vertebral através do processo de resegmentação. Neste, cada vértebra é formada pela junção da metade caudal de um esclerótomo com a metade rostral do esclerótomo seguinte. A fissura que separa as duas metades do esclerótomo, denominada “fissura de Von Ebner”, é então o primeiro sinal morfológico da segmentação das vértebras. Nestes animais o papel da notocorda é ainda uma incógnita, já que experiências de remoção desta estrutura resultam na formação de corpos de vértebra fundidos. Por outro lado, o tamanho da notocorda relativamente ao embrião é consideravelmente maior no embrião de peixe-zebra do que no de galinha. O contrário acontece com o esclerótomo, em que este corresponde à maior percentagem de tamanho do sómito maduro no embrião de galinha, sendo apenas uma fina linha de células no embrião de peixe-zebra. Isto leva-nos questionar que transformações poderão ter ocorrido que explicariam estas diferenças. A chave para a resposta a esta pergunta está no processo de desenvolvimento, já que, muitas vezes, as diferenças neste processo são a razão para as diferenças morfológicas observadas entre espécies. Tanto a notocorda como os sómitos provém de células da mesoderme, mais especificamente da mesoderme axial e paraxial, respectivamente. Durante o processo de desenvolvimento, existem zonas progenitoras que contém factores de transcrição, cuja expressão controla o seu destino. Mutações nestes genes podem causar transformações homeóticas, isto é, conversão das células de uma estrutura noutra diferente. Dois genes descobertos em peixe-zebra, quando mutados, causam alterações deste género: O gene flating head (flh), quando mutado, leva à transformação total da notocorda em sómito, enquanto o gene spadetail (spt) leva a uma conversão parcial de células dos sómitos em notocorda. Foi então descoberto que o flh reprime o spt em células progenitoras de notocorda, levando-as a assumir um destino de notocorda em vez de sómito. Assim sendo, os objectivos desta tese foram 1) clarificar o papel da notocorda na formação do corpo da vértebra; 2) investigar se a razão das diferenças observadas no papel da notocorda neste processo se deve à alteração nos territórios de expressão de genes como o flh ou o spt. No capítulo II procedemos ao estudo do efeito da notocorda e do dermamiótomo na segmentação do corpo da vértebra, usando para tal a fissura de Von Ebner como indicador desta segmentação. Para o fazer, começamos por descrever este marco morfológico, tendo descoberto que ele aparece em embriões a partir do sómito IX, Com este conhecimento adquirido, procedemos a experiências de remoção da notocorda e do dermomiótomo e avaliação da presença da fissura de Von Ebner. Em ambas as experiências, a fissura manteve-se inalterada, sugerindo que as duas estruturas não possuem um papel na segmentação do corpo da vértebra.(…)
Description
Keywords
Vertebral body development Notochord Sclerotome Axial/paraxial mesoderm progenitors Axial elongation CNOT2