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Action mechanisms of deflamin in the treatment of colorectal cancer
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Abstract(s)
CRC is the third most common cancer in the world and the second leading cause of death worldwide, being its mortality associated with the dissemination to distant organs. For cancer to become invasive and metastatic it is necessary that a remodeling of the extracellular matrix occurs being the matrix metalloproteases (MMPs) the main molecules involved in this process. Since MMPs have major implications for migratory and angiogenic processes, promoting greater tumor malignancy, they are strong candidates to targeted therapies in order to delay malignant progression.
Deflamin is a 17 kDa oligomeric protein extracted from the white lupine seeds (Lupinus albus) with anti-inflammatory and MMP-2 and 9 inhibitory functions. Deflamin has been shown to induce an improvement of the colonic mucosa and inhibit the migratory activity in CRC cell lines. In in vivo studies previously developed in our lab, deflamin was shown to exert an anti-tumor and pro-apoptotic activity. In this context, my work aimed to clarify the mechanism of deflamin action using 3D and in vivo zebrafish xenotransplant models.
Overall, my results demonstrate that deflamin has an inhibitory role of the tumoral invasive process without significantly affecting proliferation of CRC cell lines. Regarding in vivo analysis, I found a trend towards less vessel infiltration in deflamin treated groups. Deflamin has also shown to be effective in reducing collagen degradation in the tumor microenvironment of zebrafish treated animals, indicating less extracellular matrix remodeling.
These results agree with results obtained previously in CRC lines and in vivo assays. Therefore, increasing our knowledge on the role of deflamin for CRC development has the potential to reveal a new nutritional therapeutic approach, with major implications for the health and well-being of CRC patients.
O cancro colorretal (CRC) é a terceira neoplasia maligna mais comumente diagnosticada e a segunda causa de morte por cancro a nível mundial. O prognóstico dos pacientes é essencialmente estimado com base no estadio no qual a doença é detetada, sendo que em estadios iniciais a taxa de sobrevivência pode chegar até 90% e em estadios metastáticos apenas a 12%. Neste sentido, a mortalidade por CRC está amplamente associada à sua disseminação a órgãos distantes. O CRC resulta de uma acumulação progressiva de alterações genéticas e epigenéticas em oncogenes e/ou genes supressores tumorais. Deste modo, e devido à elevada taxa mutacional, o epitélio normal transforma-se numa mucosa hiper-proliferativa e, subsequentemente, dá origem a um adenoma benigno que evolui para carcinoma e posteriormente metástase. Para que o cancro se torne invasivo e metastático, é necessário que ocorra, dentro dos principais mecanismos, uma reconfiguração da matriz extracelular por degradação dos seus substratos, sendo a principal molécula com ação degradadora da matriz as metaloproteases de matriz (MMPs). As MMPs compreendem uma grande família de endopeptídases capazes de degradar praticamente todos os componentes presentes na matriz extracelular, desempenhando um papel crucial na manutenção da homeostasia da matriz, bem como para o crescimento tumoral, invasão e metástase. Estas enzimas proteolíticas estão amplamente associadas com o desenvolvimento invasivo e metastático do CRC, sendo que a sua atividade é crucial para a remodelação do microambiente tumoral. Consequentemente, apresentam grandes implicações nos processos inflamatórios, migratórios e angiogénicos, promovendo uma maior malignidade do tumor, associada, por sua vez, a um pior prognóstico e a uma pior taxa de sobrevivência. Assim, devida a sua importância na progressão tumoral, as MMPs são fortes candidatas a estratégias terapêuticas voltadas para a sua inibição na tentativa de alcançar retardamento da progressão maligna, ou até mesmo para a prevenção do desenvolvimento displásico. Estas estratégias terapêuticas de inibição da atividade das MMPs têm sido estudadas desde o início dos anos 90, com um grande investimento da indústria farmacêutica. A doxiciclina é, por enquanto, a única molécula sintética aprovada no mercado com propriedades inibidoras das MMPs. Atualmente a medicina tem permitido uma abordagem diferente para doenças inflamatórias que, ou não respondem ao tratamento tradicional, ou para doentes que não querem receber a terapia padrão. Neste sentido existem estudos que apontam que o uso de moléculas exógenas naturais é uma abordagem terapêutica a ser considerada. Vários estudos relativos a polipéptidos bioativos provenientes de leguminosas têm revelado ação anti-inflamatória, anti-migratória e ainda ação inibitória de MMPs, sendo considerados uma estratégia tanto na prevenção como na progressão de CRC. Apesar de estudos sobre o tremoço branco ainda serem insuficientes e limitados em testes clínicos e laboratoriais, a literatura disponível demonstra que fatores nutricionais do tremoço, como Pis (inibidores de protéases), têm apresentado resultados quando se trata de doenças intestinais inflamatórias e no cancro colorretal. Análises utilizando apenas extratos proteicos demonstram que são capazes de diminuir significativamente a atividade enzimática da MMP-9, proliferação e migração em linhas de células de CRC (HT29). A deflamina é uma proteína oligomérica de 17kDa, considerada inibidora de metaloproteases (MMPI), encontrada nas sementes de tremoço branco (Lupinus albus) com um grande potencial anti-inflamatório e de ação inibitória tanto da MMP-9 como da MMP-2. Foi demonstrado que é capaz de induzir uma melhoria do perfil da mucosa colónica em processos de colites ulcerativas e, mais recentemente, promover a inibição da atividade migratória em linhas celulares de cancro colorretal, bem como inibição da atividade gelanolítica da MMP-2 e MMP-9. Em estudos in vivo desenvolvidos no nosso laboratório, a deflamina exerceu também uma atividade anti-tumoral e pró-apoptótica, diminuindo o tamanho de tumores xenotransplantados em modelos de zebrafish e aumentando a taxa apoptótica dos mesmos sem afetar a divisão celular. Neste sentido este trabalho teve como principal objetivo verificar a atividade da deflamina sobre linhas celulares de CRC, recorrendo a modelos celulares 3D, com o intuito de perceber se a sua atividade era replicável. Do mesmo modo, verificou-se a sua atividade anti tumoral em modelos in vivo com peixe-zebra (Danio rerio) através da análise de processos angiogénicos e de degradação da matriz extracelular Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a deflamina não exerce uma ação direta no ciclo celular nem induz apoptose em linhas de CRC tratadas com este agente, sugerindo assim a sua segurança como potencial estratégia terapêutica contra o CRC. Para as análises in vitro com modelos 3D de esferoides, a deflamina apresentou uma atividade inibitória do processo invasivo em matriz de colagénio para as linhas celulares HT29, HCT116 e SW480 (p=0,0464; p=0,0482 e p=0,0130, respetivamente), apesar de não ter afetado significativamente a proliferação celular das linhas HCT116 e SW480 (p=0,8571 e p=0,1850, respetivamente), o que reforça a sua atividade inibitória de invasão, previamente descrita em culturas celulares 2D. Relativamente às análises com modelos in vivo em modelos de peixe-zebra, apesar da deflamina não afetar a formação de novos vasos sanguíneos, existe uma tendência observada para uma menor infiltração de vasos sanguíneos no centro da massa tumoral em peixes do grupo tratado (100μg/mL) quando comparados com o grupo controlo (p=0,1093). Além desta tendência, a deflamina mostrou-se eficaz na redução de degradação de colagénio no nicho tumoral em indivíduos tratados em relação aos controlos (p=0,0168), indicando assim uma menor remodelação da matriz extracelular. Os nossos resultados mostraram-se de acordo com resultados obtidos anteriormente por o grupo de investigadores do ISA, bem como por experiências anteriores desenvolvidas pelo grupo LCosta do iMM. Deste modo, esta dissertação complementa os estudos previamente elaborados e explora mecanisticamente a ação que a deflamina exerce sobre o desenvolvimento e progressão de CRC. Em estudos futuros, seria interessante investigar o papel que a deflamina exerce na atividade de metaloproteases, nomeadamente da MMP-9, em ensaios com modelos celulares 3D, bem como em ensaios in vivo. É também de extrema importância investigar os efeitos relativos à cito- e genotoxicidade da deflamina. Por atuar in situ e, aparentemente, não ser absorvida no sistema digestivo, a deflamina potencialmente contorna a maioria dos problemas relacionados aos MMPIs apresentados anteriormente em ensaios clínicos, associados a alta toxicidade e efeitos secundários sistémicos. Aprofundar os conhecimentos já existentes sobre o papel desta proteína poderia revelar uma nova abordagem terapêutica nutricional, com importantes implicações para a saúde e o bem-estar dos pacientes com CRC. Além disso, foi proposto um enriquecimento nutricional de alimentos com deflamina, o que poderia ser uma estratégia para prevenir as doenças intestinais inflamatórias associadas ao cancro colorretal.
O cancro colorretal (CRC) é a terceira neoplasia maligna mais comumente diagnosticada e a segunda causa de morte por cancro a nível mundial. O prognóstico dos pacientes é essencialmente estimado com base no estadio no qual a doença é detetada, sendo que em estadios iniciais a taxa de sobrevivência pode chegar até 90% e em estadios metastáticos apenas a 12%. Neste sentido, a mortalidade por CRC está amplamente associada à sua disseminação a órgãos distantes. O CRC resulta de uma acumulação progressiva de alterações genéticas e epigenéticas em oncogenes e/ou genes supressores tumorais. Deste modo, e devido à elevada taxa mutacional, o epitélio normal transforma-se numa mucosa hiper-proliferativa e, subsequentemente, dá origem a um adenoma benigno que evolui para carcinoma e posteriormente metástase. Para que o cancro se torne invasivo e metastático, é necessário que ocorra, dentro dos principais mecanismos, uma reconfiguração da matriz extracelular por degradação dos seus substratos, sendo a principal molécula com ação degradadora da matriz as metaloproteases de matriz (MMPs). As MMPs compreendem uma grande família de endopeptídases capazes de degradar praticamente todos os componentes presentes na matriz extracelular, desempenhando um papel crucial na manutenção da homeostasia da matriz, bem como para o crescimento tumoral, invasão e metástase. Estas enzimas proteolíticas estão amplamente associadas com o desenvolvimento invasivo e metastático do CRC, sendo que a sua atividade é crucial para a remodelação do microambiente tumoral. Consequentemente, apresentam grandes implicações nos processos inflamatórios, migratórios e angiogénicos, promovendo uma maior malignidade do tumor, associada, por sua vez, a um pior prognóstico e a uma pior taxa de sobrevivência. Assim, devida a sua importância na progressão tumoral, as MMPs são fortes candidatas a estratégias terapêuticas voltadas para a sua inibição na tentativa de alcançar retardamento da progressão maligna, ou até mesmo para a prevenção do desenvolvimento displásico. Estas estratégias terapêuticas de inibição da atividade das MMPs têm sido estudadas desde o início dos anos 90, com um grande investimento da indústria farmacêutica. A doxiciclina é, por enquanto, a única molécula sintética aprovada no mercado com propriedades inibidoras das MMPs. Atualmente a medicina tem permitido uma abordagem diferente para doenças inflamatórias que, ou não respondem ao tratamento tradicional, ou para doentes que não querem receber a terapia padrão. Neste sentido existem estudos que apontam que o uso de moléculas exógenas naturais é uma abordagem terapêutica a ser considerada. Vários estudos relativos a polipéptidos bioativos provenientes de leguminosas têm revelado ação anti-inflamatória, anti-migratória e ainda ação inibitória de MMPs, sendo considerados uma estratégia tanto na prevenção como na progressão de CRC. Apesar de estudos sobre o tremoço branco ainda serem insuficientes e limitados em testes clínicos e laboratoriais, a literatura disponível demonstra que fatores nutricionais do tremoço, como Pis (inibidores de protéases), têm apresentado resultados quando se trata de doenças intestinais inflamatórias e no cancro colorretal. Análises utilizando apenas extratos proteicos demonstram que são capazes de diminuir significativamente a atividade enzimática da MMP-9, proliferação e migração em linhas de células de CRC (HT29). A deflamina é uma proteína oligomérica de 17kDa, considerada inibidora de metaloproteases (MMPI), encontrada nas sementes de tremoço branco (Lupinus albus) com um grande potencial anti-inflamatório e de ação inibitória tanto da MMP-9 como da MMP-2. Foi demonstrado que é capaz de induzir uma melhoria do perfil da mucosa colónica em processos de colites ulcerativas e, mais recentemente, promover a inibição da atividade migratória em linhas celulares de cancro colorretal, bem como inibição da atividade gelanolítica da MMP-2 e MMP-9. Em estudos in vivo desenvolvidos no nosso laboratório, a deflamina exerceu também uma atividade anti-tumoral e pró-apoptótica, diminuindo o tamanho de tumores xenotransplantados em modelos de zebrafish e aumentando a taxa apoptótica dos mesmos sem afetar a divisão celular. Neste sentido este trabalho teve como principal objetivo verificar a atividade da deflamina sobre linhas celulares de CRC, recorrendo a modelos celulares 3D, com o intuito de perceber se a sua atividade era replicável. Do mesmo modo, verificou-se a sua atividade anti tumoral em modelos in vivo com peixe-zebra (Danio rerio) através da análise de processos angiogénicos e de degradação da matriz extracelular Os resultados obtidos neste trabalho demonstram que a deflamina não exerce uma ação direta no ciclo celular nem induz apoptose em linhas de CRC tratadas com este agente, sugerindo assim a sua segurança como potencial estratégia terapêutica contra o CRC. Para as análises in vitro com modelos 3D de esferoides, a deflamina apresentou uma atividade inibitória do processo invasivo em matriz de colagénio para as linhas celulares HT29, HCT116 e SW480 (p=0,0464; p=0,0482 e p=0,0130, respetivamente), apesar de não ter afetado significativamente a proliferação celular das linhas HCT116 e SW480 (p=0,8571 e p=0,1850, respetivamente), o que reforça a sua atividade inibitória de invasão, previamente descrita em culturas celulares 2D. Relativamente às análises com modelos in vivo em modelos de peixe-zebra, apesar da deflamina não afetar a formação de novos vasos sanguíneos, existe uma tendência observada para uma menor infiltração de vasos sanguíneos no centro da massa tumoral em peixes do grupo tratado (100μg/mL) quando comparados com o grupo controlo (p=0,1093). Além desta tendência, a deflamina mostrou-se eficaz na redução de degradação de colagénio no nicho tumoral em indivíduos tratados em relação aos controlos (p=0,0168), indicando assim uma menor remodelação da matriz extracelular. Os nossos resultados mostraram-se de acordo com resultados obtidos anteriormente por o grupo de investigadores do ISA, bem como por experiências anteriores desenvolvidas pelo grupo LCosta do iMM. Deste modo, esta dissertação complementa os estudos previamente elaborados e explora mecanisticamente a ação que a deflamina exerce sobre o desenvolvimento e progressão de CRC. Em estudos futuros, seria interessante investigar o papel que a deflamina exerce na atividade de metaloproteases, nomeadamente da MMP-9, em ensaios com modelos celulares 3D, bem como em ensaios in vivo. É também de extrema importância investigar os efeitos relativos à cito- e genotoxicidade da deflamina. Por atuar in situ e, aparentemente, não ser absorvida no sistema digestivo, a deflamina potencialmente contorna a maioria dos problemas relacionados aos MMPIs apresentados anteriormente em ensaios clínicos, associados a alta toxicidade e efeitos secundários sistémicos. Aprofundar os conhecimentos já existentes sobre o papel desta proteína poderia revelar uma nova abordagem terapêutica nutricional, com importantes implicações para a saúde e o bem-estar dos pacientes com CRC. Além disso, foi proposto um enriquecimento nutricional de alimentos com deflamina, o que poderia ser uma estratégia para prevenir as doenças intestinais inflamatórias associadas ao cancro colorretal.
Description
Keywords
Deflamin Matrix metalloproteinases Zebrafish 3D spheroids.