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Analysis of mutational allelic imbalances’ Influence on drug treatment response
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Authors
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Abstract(s)
Breast cancer exhibits significant heterogeneity across various dimensions concerning histological and molecular classification, as well as mutational profile and clinical outcome. Defining treatment courses is likewise a complex task, as patients share similar features but different clinical prognoses. Nowadays, prognostic assessment tries to capture the morphologic and genetic variation within breast tumours, employing a variety of multigene molecular tests focusing on measuring gene expression of a specific gene panel, to predict patient outcome.
In current clinical practice, the assessment of the PIK3CA mutational status is a routine procedure for hormone-receptor positive, HER2 negative metastatic breast cancers. Evaluation of gain-of-function mutations in the PIK3CA gene within this patient cohort helps to identify individuals who may benefit from systemic treatment with alpelisib, a PI3Kα-specific inhibitor. Previous studies have demonstrated that widespread allelic imbalances in the expression of somatic mutations in PIK3CA are associated with prognosis in breast cancer. Particularly, preferential expression of PIK3CA’s mutated allele is associated with poorer prognosis.
Here, we hypothesise that differential allelic expression of PIK3CA mutations influences protein levels in breast cancer cells, thereby potentially affecting drug treatment response. We aimed to create an inducible PIK3CA breast cell-based tool capable of inducing different levels of PIK3CA mutational expressions as a platform to evaluate the impact of mutational expression levels on the response to PI3K-targeted therapies. Our goal was to create a cell-based system to precisely identify patients eligible for PI3K-α inhibitor therapies by modelling PIK3CA mutant expression dosages and assessing cell drug response.
Our results show that we successfully generated a plasmid capable of constitutively expressing the wild-type isoform of the PIK3CA gene and also three inducible plasmids that can express three different levels of each PIK3CA mutant in a controlled manner. These plasmids constitute the tools required to transfect breast cell lines and generate the PIK3CA inducible system. Once the system is not yet created, our hypothesis is still subject to proof.
O cancro da mama é globalmente a neoplasia mais prevalente em ambos os géneros, segundo dados de 2020. A sua incidência tem vindo a aumentar, mais especificamente os tumores positivos para recetores de estrogénio. As projeções para 2040 indicam uma crescente incidência e um aumento de 50% em mortalidade. Observa-se evidente heterogeneidade na classificação histológica e molecular dos tumores da mama, como também no perfil mutacional e no prognóstico clínico. Definir os tratamentos adequados a cada paciente depende do estadiamento tumoral, como também da avaliação dos biomarcadores tumorais. Estes biomarcadores são preditivos de resposta às terapias, como também prognósticos de sobrevivência global e recorrência. Apesar das várias terapêuticas disponíveis, a escolha do melhor tratamento para cada indivíduo demonstra-se complexa, uma vez que pacientes que partilham características tumorais semelhantes por vezes apresentam prognósticos distintos. Atualmente, vários testes moleculares de caracter prognóstico estão disponíveis para análise da expressão mutacional de genes mais frequentemente mutados no cancro da mama. O gene PIK3CA corresponde a um dos genes mais frequentemente mutados no cancro da mama, sendo prevalente em cerca de 40% dos tumores mamários. Mutações neste gene são frequentes em tumores luminais, especialmente no subtipo luminal A. Mais de 80% das mutações somáticas missense no gene PIK3CA ocorrem nos domínios helical e quinase, sendo as mutações E545K e a H1047R as duas mais frequentes de cada domínio, respetivamente. Devido à prevalência de mutações neste gene em tumores da mama e ao seu papel central numa das vias mais mutadas em cancro, a via PI3K/Akt, é de grande importância o estudo do seu impacto na patogénese mamária. Até recentemente, apesar das diversas terapias dirigidas para a quinase PI3K, nenhuma terapia estava disponível para os cancros da mama com mutações presentes no gene PIK3CA. Atualmente, um fármaco inibidor e específico para a subunidade catalítica p110α da PI3K (PI3K-α), o alpelisib, foi aprovado para tumores da mama metastáticos, recetores-hormonais positivos, HER2 negativos que contenham mutações no gene PIK3CA, em combinação com tratamento hormonal. Pacientes tratados com alpelisib-fulvestrant demonstram melhor resposta geral e uma sobrevivência livre de progressão de 11 meses em comparação com os 5.7 meses dos indivíduos tratados com placebo. Desta forma, o gene PIK3CA assume o papel de biomarcador tumoral, avaliado na prática clínica em casos de tumores da mama avançados e refratários à terapêutica administrada. Inúmeros estudos demonstraram diversos eventos de expressão variável de alelos, resultando em expressão alélica desigual. Estas variações alélicas, muitas vezes resultante de cis-regulação, ocorrem tanto em situações fisiológicas, como também em diversas patologias, nomeadamente em cancro. Em contexto tumoral, esta expressão desigual associada a um gene mutado apresenta com frequência expressão preferencial do alelo mutado. Esta expressão desigual já foi descrita em mutações de tumores da mama, nomeadamente no gene PIK3CA, com expressão preferencial do alelo mutado. Esta expressão preferencial foi associada a um pior prognóstico dos pacientes. Os indivíduos com patologia tumoral mamária avançada ou metastática, que apresentem recetores de estrogénio positivos, HER2 negativo, num quadro de recorrência tumoral, são avaliados quanto à presença de mutação no gene PIK3CA. Uma deteção positiva torna-os elegíveis para tratamento com o alpelisib. No entanto, é passível que estes indivíduos tenham uma expressão desigual dos alelos, seja por expressão preferencial do alelo PIK3CA mutado em doses variáveis, ou então por expressão ausente do alelo mutado. A hipótese proposta no presente estudo é que diferentes níveis de expressão do alelo mutado do gene PIK3CA afetam os níveis de ARN e de proteína expressos, possivelmente impactando a resposta a fármacos-alvo, em oposição a tumores que expressem de forma residual ou não expressem de todo a mutação presente no gene PIK3CA. A deteção de mutações neste gene é atualmente um dos critérios estabelecidos para eleger pacientes para tratamento com o inibidor PI3K-α alpelisib. A deteção destas mutações não tem em consideração a possível expressão desigual dos alelos. A não expressão da mutação pode ser um indicador de uma ineficiente resposta clínica à terapêutica. Confirmando-se a hipótese proposta, os pacientes não beneficiam desta terapia direcionada e a expressão mutacional deve ser fator de exclusão nestes pacientes que atualmente estão elegíveis para terapia com alpelisib. De forma a testar esta hipótese, foram gerados dois tipos de plasmídeos através de clonagem usando a tecnologia Gateway. Através deste sistema de recombinação, foi gerado um plasmídeo capaz de expressar constitutivamente o gene PIK3CA selvagem, com fusão da proteína fluorescente mCherry à nossa proteína de interesse, a PI3K-α. Outros três plasmídeos foram gerados, de forma a expressar as mutações PIK3CA E453Q, E545K e H1047R de forma induzível e associada a um Flag. Estes plasmídeos foram construídos desta forma para permitir a sua deteção específica por western-blot através do uso de anticorpos anti-mCherry e anti-Flag. A transfeção destes plasmídeos para as linhas celulares mamárias MCF10A, MCF7 e BT-20 pressupõe a criação de uma ferramenta celular passível de gerar diferentes níveis de expressão do alelo mutado em simultâneo com a expressão do alelo selvagem. O objetivo desta ferramenta é gerar linhas celulares mamárias que expressem, de forma controlada, níveis variáveis das diferentes mutações PIK3CA, permitindo avaliar o impacto dessa expressão diferenciada na resposta a fármacos direcionados. A transfeção dos plasmídeos gerados não resultou em células positivamente transfectadas, tendo esta validação realizada ao microscópico pela não identificação de células que expressassem fluorescência vermelha (plasmídeo contendo a versão selvagem do gene PIK3CA). Fatores como confluência celular, quantidade de DNA ou quantidade de Lipofectamina 3000, como também diferentes métodos de transfeção foram testados com vista a otimização das condições de transfeção. As diversas otimizações não resultaram na obtenção de células transfectadas. Outros métodos de transfeção serão avaliados, de forma a permitir a criação do sistema induzível proposto nestas linhas celulares mamárias. Neste estudo foi possível a criação das ferramentas necessárias para gerar linhas que expressem diferentes mutações PIK3CA, de forma induzível, as quais serão futuramente utilizadas para a criação das linhas celulares mamárias. Este estudo visa futuramente identificar os indivíduos não elegíveis para os tratamentos direcionados para mutações no gene PIK3CA e que possam não beneficiar desta terapêutica, evitando assim terapias com grande impacto físico e emocional para os pacientes.
O cancro da mama é globalmente a neoplasia mais prevalente em ambos os géneros, segundo dados de 2020. A sua incidência tem vindo a aumentar, mais especificamente os tumores positivos para recetores de estrogénio. As projeções para 2040 indicam uma crescente incidência e um aumento de 50% em mortalidade. Observa-se evidente heterogeneidade na classificação histológica e molecular dos tumores da mama, como também no perfil mutacional e no prognóstico clínico. Definir os tratamentos adequados a cada paciente depende do estadiamento tumoral, como também da avaliação dos biomarcadores tumorais. Estes biomarcadores são preditivos de resposta às terapias, como também prognósticos de sobrevivência global e recorrência. Apesar das várias terapêuticas disponíveis, a escolha do melhor tratamento para cada indivíduo demonstra-se complexa, uma vez que pacientes que partilham características tumorais semelhantes por vezes apresentam prognósticos distintos. Atualmente, vários testes moleculares de caracter prognóstico estão disponíveis para análise da expressão mutacional de genes mais frequentemente mutados no cancro da mama. O gene PIK3CA corresponde a um dos genes mais frequentemente mutados no cancro da mama, sendo prevalente em cerca de 40% dos tumores mamários. Mutações neste gene são frequentes em tumores luminais, especialmente no subtipo luminal A. Mais de 80% das mutações somáticas missense no gene PIK3CA ocorrem nos domínios helical e quinase, sendo as mutações E545K e a H1047R as duas mais frequentes de cada domínio, respetivamente. Devido à prevalência de mutações neste gene em tumores da mama e ao seu papel central numa das vias mais mutadas em cancro, a via PI3K/Akt, é de grande importância o estudo do seu impacto na patogénese mamária. Até recentemente, apesar das diversas terapias dirigidas para a quinase PI3K, nenhuma terapia estava disponível para os cancros da mama com mutações presentes no gene PIK3CA. Atualmente, um fármaco inibidor e específico para a subunidade catalítica p110α da PI3K (PI3K-α), o alpelisib, foi aprovado para tumores da mama metastáticos, recetores-hormonais positivos, HER2 negativos que contenham mutações no gene PIK3CA, em combinação com tratamento hormonal. Pacientes tratados com alpelisib-fulvestrant demonstram melhor resposta geral e uma sobrevivência livre de progressão de 11 meses em comparação com os 5.7 meses dos indivíduos tratados com placebo. Desta forma, o gene PIK3CA assume o papel de biomarcador tumoral, avaliado na prática clínica em casos de tumores da mama avançados e refratários à terapêutica administrada. Inúmeros estudos demonstraram diversos eventos de expressão variável de alelos, resultando em expressão alélica desigual. Estas variações alélicas, muitas vezes resultante de cis-regulação, ocorrem tanto em situações fisiológicas, como também em diversas patologias, nomeadamente em cancro. Em contexto tumoral, esta expressão desigual associada a um gene mutado apresenta com frequência expressão preferencial do alelo mutado. Esta expressão desigual já foi descrita em mutações de tumores da mama, nomeadamente no gene PIK3CA, com expressão preferencial do alelo mutado. Esta expressão preferencial foi associada a um pior prognóstico dos pacientes. Os indivíduos com patologia tumoral mamária avançada ou metastática, que apresentem recetores de estrogénio positivos, HER2 negativo, num quadro de recorrência tumoral, são avaliados quanto à presença de mutação no gene PIK3CA. Uma deteção positiva torna-os elegíveis para tratamento com o alpelisib. No entanto, é passível que estes indivíduos tenham uma expressão desigual dos alelos, seja por expressão preferencial do alelo PIK3CA mutado em doses variáveis, ou então por expressão ausente do alelo mutado. A hipótese proposta no presente estudo é que diferentes níveis de expressão do alelo mutado do gene PIK3CA afetam os níveis de ARN e de proteína expressos, possivelmente impactando a resposta a fármacos-alvo, em oposição a tumores que expressem de forma residual ou não expressem de todo a mutação presente no gene PIK3CA. A deteção de mutações neste gene é atualmente um dos critérios estabelecidos para eleger pacientes para tratamento com o inibidor PI3K-α alpelisib. A deteção destas mutações não tem em consideração a possível expressão desigual dos alelos. A não expressão da mutação pode ser um indicador de uma ineficiente resposta clínica à terapêutica. Confirmando-se a hipótese proposta, os pacientes não beneficiam desta terapia direcionada e a expressão mutacional deve ser fator de exclusão nestes pacientes que atualmente estão elegíveis para terapia com alpelisib. De forma a testar esta hipótese, foram gerados dois tipos de plasmídeos através de clonagem usando a tecnologia Gateway. Através deste sistema de recombinação, foi gerado um plasmídeo capaz de expressar constitutivamente o gene PIK3CA selvagem, com fusão da proteína fluorescente mCherry à nossa proteína de interesse, a PI3K-α. Outros três plasmídeos foram gerados, de forma a expressar as mutações PIK3CA E453Q, E545K e H1047R de forma induzível e associada a um Flag. Estes plasmídeos foram construídos desta forma para permitir a sua deteção específica por western-blot através do uso de anticorpos anti-mCherry e anti-Flag. A transfeção destes plasmídeos para as linhas celulares mamárias MCF10A, MCF7 e BT-20 pressupõe a criação de uma ferramenta celular passível de gerar diferentes níveis de expressão do alelo mutado em simultâneo com a expressão do alelo selvagem. O objetivo desta ferramenta é gerar linhas celulares mamárias que expressem, de forma controlada, níveis variáveis das diferentes mutações PIK3CA, permitindo avaliar o impacto dessa expressão diferenciada na resposta a fármacos direcionados. A transfeção dos plasmídeos gerados não resultou em células positivamente transfectadas, tendo esta validação realizada ao microscópico pela não identificação de células que expressassem fluorescência vermelha (plasmídeo contendo a versão selvagem do gene PIK3CA). Fatores como confluência celular, quantidade de DNA ou quantidade de Lipofectamina 3000, como também diferentes métodos de transfeção foram testados com vista a otimização das condições de transfeção. As diversas otimizações não resultaram na obtenção de células transfectadas. Outros métodos de transfeção serão avaliados, de forma a permitir a criação do sistema induzível proposto nestas linhas celulares mamárias. Neste estudo foi possível a criação das ferramentas necessárias para gerar linhas que expressem diferentes mutações PIK3CA, de forma induzível, as quais serão futuramente utilizadas para a criação das linhas celulares mamárias. Este estudo visa futuramente identificar os indivíduos não elegíveis para os tratamentos direcionados para mutações no gene PIK3CA e que possam não beneficiar desta terapêutica, evitando assim terapias com grande impacto físico e emocional para os pacientes.
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Cancro da mama pik3ca Expressão diferencial de alelos Desequilíbrio alélico Inibidores pi3k-?