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Mechanisms of de novo bone formation in a fish model of fin regenaration
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 28.61 MB | Adobe PDF |
Advisor(s)
Abstract(s)
Unveiling the basis of animal tissue regeneration may contribute to the better
understanding of disease mechanisms and the development of novel therapeutic
strategies. Regeneration-competent animals are also valuable tools in drug
discovery and for studying basic mechanisms of development. Bone is a dynamic
tissue, formed and maintained through a balance between matrix deposition by
osteoblasts and resorption by osteoclasts. When bone remodelling fails to
homeostatic equilibrium, degenerative and dysplastic diseases may develop.
Moreover, human bone is unable to completely restore structure and function after
trauma. Hence, this work aimed at uncovering novel players in bone formation and
patterning in an innovative system, the zebrafish regenerating caudal fin.
A comprehensive set of imaging and analytical methodologies were first
development and optimized to track bone formation and regeneration in a precise
and timely manner throughout fin epimorphic regeneration. To gain insights into
cellular and molecular programs underlying bone regeneration, the transcriptome
of regenerates at distinct stages (blastema formation and regenerative outgrowth)
was analysed. RNA-Seq data pointed toward a role of osteoclasts and calcitonin in
ray patterning. Calcitonin-specific inhibition of osteoclast activity impaired ray
bifurcation and demonstrated the central role that osteoclasts play in this process.
Evidence toward calcitonin-specific regulation of osteoclast differentiation in the
context of ray bifurcation, was also collected. To further study the mechanisms
underlying bone formation, a swim-training regeneration model was established. In
this model, bone formation during regeneration was stimulated and ray bifurcation
was accelerated upon increased mechanical loading, further demonstrating the
suitability of this system to investigate underlying mechanisms.
This work provided valuable technical advancements for the study of bone
regeneration in zebrafish and identified novel players in ray formation and
patterning (i.e. bifurcation). Altogether, this work also proposes the zebrafish
bifurcating fin ray as a potential model for tetrapod digit specification and
associated diseases.
Desvendar a base dos mecanismos de regeneração de tecidos animais poderá contribuir para compreender mecanismos de doença e desenvolver estratégias terapêuticas. Os animais capazes de regenerar órgãos e tecidos são, também, ferramentas-chave para a descoberta de fármacos e para o estudo de mecanismos básicos de desenvolvimento. O osso é um tecido altamente dinâmico, sendo formado e mantido através de um balanço entre os processos de deposição de matriz por osteoblastos e reabsorção por osteoclastos. Uma desregulação deste equilíbrio homeostático no processo de remodelação óssea pode levar a várias doenças degenerativas e displásticas. Para além disso, o osso humano, apesar de reparar, não tem a capacidade de restaurar eficientemente a estrutura e função após trauma. Ao contrário dos mamíferos, o peixe-zebra tem a capacidade de regenerar inúmeros órgãos, incluindo a barbatana caudal, que é composta por vários tipos de tecido, incluindo raios ósseos. Morfologicamente, estes raios são compostos por dois hemiraios, que são segmentados e bifurcados. Após amputação da barbatana caudal, células da epiderme migram rapidamente para cobrir o dano. Subsequentemente, células maturas abaixo do plano de amputação de-diferenciam, migram para a zona danificada, proliferam e formam uma estrutura intermédia, altamente heterogénea, designada de blastema. As células desta estrutura re-diferenciam então gradualmente, num eixo proximal-distal, para formar uma réplica funcional e estruturalmente equivalente à barbatana original. Deste modo, o objetivo principal do presente trabalho consiste na revelação de novos intervenientes na formação e padronização do osso, utilizando um sistema inovador, a barbatana caudal do peixezebra em regeneração. A constante avaliação de perfis mineralogénicos e de fenótipos de padronização dos raios em regeneração da barbatana caudal foi essencial durante todo o trabalho, de modo a concretizar os objetivos globais propostos. Neste sentido, foi inicialmente desenvolvido um vasto conjunto de metodologias laboratoriais e de análise de imagem, necessárias à visualização e ao seguimento da formação óssea. Foi primeiro desenvolvida uma metodologia para coloração vital do osso de peixe-zebra, baseada em microscopia de fluorescência e recorrendo a concentrações baixas e não tóxicas de vermelho de alizarina S (ARS). Esta metodologia, otimizada em larvas e posteriormente aplicada em barbatanas caudais em regeneração, permitiu seguir detalhadamente as estruturas ósseas mineralizadas ou em mineralização nas barbatanas e mostrou ser particularmente vantajosa em combinação com outros fluorocromos, como a proteína verde fluorescente (GFP). Efetuou-se, então, uma caracterização cronológica detalhada dos principais eventos estruturais durante a regeneração dos raios da barbatana (i.e. início de mineralização, segmentação e bifurcação), essencial para avaliar fenótipos relacionados com os tempos e padrões de formação óssea. Foram ainda desenvolvidos e otimizados vários procedimentos analíticos para avaliar as performances regenerativas e mineralogénicas de um modo preciso, testados em amostras fixadas e em espécimes vivos, e aplicados com sucesso em peixes expostos a ácido retinóico e varfarina. As ferramentas, os procedimentos e as metodologias desenvolvidas e estandardizadas no contexto deste trabalho, beneficiarão certamente a investigação nas áreas da medicina regenerativa, engenharia de tecidos e biologia do osso. Em última análise, contribuem para o estabelecimento do peixe-zebra como uma ferramenta valiosa para a descoberta de fármacos, em particular para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças ósseas. De modo a obter evidências relativamente a mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação e padronização dos raios da barbatana caudal, foi analisado os transcriptoma de regenerados em estádios característicos de formação do blastema e proliferação celular (24 hpa – horas pós amputação), assim como de crescimento regenerativo e formação/padronização dos raios (72 hpa; início da bifurcação). De entre os genes associados a desenvolvimento esquelético, calca surgiu como o mRNA mais sobre-expresso durante a formação e padronização dos raios. Considerando a função da Calcitonina (uma hormona hipocalcémica secretada, codificada pelo gene calca) na inibição da atividade e diferenciação osteoclástica foi gerada a hipótese de que os osteoclastos estariam envolvidos na padronização dos raios ósseos. De entre os processos de padronização que ocorrem durante a morfogénese dos raios da barbatana, a bifurcação é, provavelmente, um dos que menos se conhece. Sabe-se que o Sonic hedgehog (Shh) é um regulador essencial deste processo, no entanto, é insuficiente para estabelecer a posição final da bifurcação. Uma caracterização pormenorizada do processo de bifurcação permitiu a definição de três fases distintas, mas complementares, durante este processo. Uma primeira fase – fase de divisão – é caracterizada pela divisão do raio induzida por sinalização morfogenética, como Shh. Uma segunda fase – fase de fusão – é caracterizada pela fusão dos raios segregados, mediada por osteoblastos. Finalmente, uma terceira fase – fase de determinação – é caracterizada por atividade anti-fusão para determinar a posição final da bifurcação do raio, de forma precisa. Os dados disponíveis (incluindo os descritos neste trabalho) sugerem que esta última fase de determinação poderá ser mediada por osteoclastos. Neste sentido, mostrámos a presença de osteoclastos e da enzima Trap, por eles secretada, nos locais de bifurcação. Demonstrámos também que a inibição da atividade osteoclástica com calcitonina de salmão é acompanhada por uma inibição do processo de bifurcação sem, no entanto, ser acompanhada por alterações relativas aos domínios de expressão de shh. Este trabalho aponta ainda para uma regulação endógena dos osteoclastos pela Calcitonina, durante o processo de bifurcação. Neste contexto, dados obtidos com a linha transgénica Tg(calca:Gal4), gerada no âmbito do presente trabalho, cruzada com Tg(UAS:GFP) sugerem que a Calcitonina poderá auto-regular os progenitores de osteoclastos, mantendo-os num estado indiferenciado. De acordo com esta hipótese, estas células progenitoras diferenciar-se-ão após inibição espacialmente controlada dos mecanismos da Calcitonina, regulando o recrutamento de osteoclastos maturos para os locais de bifurcação. Para além de gerar evidências acerca do papel dos osteoclastos e da Calcitonina na regulação do processo de bifurcação dos raios, este trabalho revelou um novo papel autócrino/parácrino da Calcitonina, para além da sua atividade endócrina clássica. Apesar das diferenças celulares intrínsecas entre o osso de peixe e mamíferos, as respostas adaptativas dos peixes teleósteos a alterações na carga mecânica são comparáveis às dos mamíferos, pelo que foi gerada a hipótese de que o osso em regeneração teria também a capacidade de responder e adaptar-se quando submetido a estímulos mecânicos. No seguimento do novo papel proposto para os osteoclastos durante a bifurcação dos raios, e de modo a obter dados adicionais relativamente os mecanismos de formação e padronização óssea durante a regeneração da barbatana caudal, foi desenvolvido um modelo de regeneração sob efeito de carga mecânica, baseado em treino de natação. Como descrito noutros modelos, foi observado um aumento na formação óssea durante a regeneração sob treino de natação, acompanhada de uma proximalização e/ou aceleração da bifurcação dos raios. Observou-se, simultaneamente, um aumento dos domínios de expressão de shh, um aumento do número de osteoblastos em estádios tardios e uma diminuição da atividade osteoclástica (sendo que o decréscimo da atividade osteoclástica observado nos locais de bifurcação é provavelmente devido a uma aceleração de todo o processo). Estes resultados sugerem que os efeitos do treino de natação na bifurcação dos raios poderão ser consequentes de um impacto geral nas fases de divisão, fusão e determinação, acima caracterizados. Para além dos efeitos morfológicos aqui descritos, o treino de natação permitiu ainda identificar novos potenciais intervenientes na formação e padronização dos raios da barbatana, como o ddit4 (possível regulador da osteoblastogénese e osteoclastogénese) e o btg2 (um possível interveniente no processo de regressão do tecido interdigital nos tetrápodes). Foi ainda proposto um provável envolvimento do gene legumain e de vários genes legumain-like no controlo da atividade osteoclástica durante a padronização dos raios, possivelmente através de uma relação neuronal-óssea mediada por mecanismos de mecano-transdução. Para além de demonstrar que o sistema de treino de natação é vantajoso para modelar os mecanismos de formação óssea em contextos de doença e regeneração, estes dados representam as primeiras descrições fenotípicas do osso em regeneração em função das condições biomecânicas. A maioria dos dados apresentados neste trabalho sugerem uma ligação morfológica e mecanística entre a bifurcação dos raios da barbatana e a especificação dos dígitos dos tetrápodes. De facto, para além de intermediários da via de sinalização Hedgehog, observou-se uma sobre-expressão de outros genes cruciais para a padronização dos membros e especificação dos dígitos (e.g. genes hox) durante a formação e padronização dos raios. Os dados de RNA-Seq mostraram ainda que os genes diferencialmente expressos entre os dois estádios analisados, estavam associados a várias doenças ósseas humanas, muitas das quais relacionadas com malformações dos dígitos, como a sindactilia (e.g. fusão digital). Os resultados deste trabalho evidenciam uma possível colaboração dos osteoclastos com outros tipos celulares (e.g. macrófagos) na remodelação do tecido inter-raio durante o processo de bifurcação, de modo comparável ao processo de regressão inter-digital nos membros de tetrápodes. Este trabalho proporcionou avanços técnicos valiosos para o estudo da regeneração óssea em peixe-zebra e permitiu a identificação de novos intervenientes na formação e padronização (i.e. bifurcação) dos raios ósseos da barbatana caudal. De um modo global, propõe-se a bifurcação dos raios da barbatana caudal do peixe-zebra como um potencial modelo para a especificação dos dígitos dos tetrápodes e doenças associadas.
Desvendar a base dos mecanismos de regeneração de tecidos animais poderá contribuir para compreender mecanismos de doença e desenvolver estratégias terapêuticas. Os animais capazes de regenerar órgãos e tecidos são, também, ferramentas-chave para a descoberta de fármacos e para o estudo de mecanismos básicos de desenvolvimento. O osso é um tecido altamente dinâmico, sendo formado e mantido através de um balanço entre os processos de deposição de matriz por osteoblastos e reabsorção por osteoclastos. Uma desregulação deste equilíbrio homeostático no processo de remodelação óssea pode levar a várias doenças degenerativas e displásticas. Para além disso, o osso humano, apesar de reparar, não tem a capacidade de restaurar eficientemente a estrutura e função após trauma. Ao contrário dos mamíferos, o peixe-zebra tem a capacidade de regenerar inúmeros órgãos, incluindo a barbatana caudal, que é composta por vários tipos de tecido, incluindo raios ósseos. Morfologicamente, estes raios são compostos por dois hemiraios, que são segmentados e bifurcados. Após amputação da barbatana caudal, células da epiderme migram rapidamente para cobrir o dano. Subsequentemente, células maturas abaixo do plano de amputação de-diferenciam, migram para a zona danificada, proliferam e formam uma estrutura intermédia, altamente heterogénea, designada de blastema. As células desta estrutura re-diferenciam então gradualmente, num eixo proximal-distal, para formar uma réplica funcional e estruturalmente equivalente à barbatana original. Deste modo, o objetivo principal do presente trabalho consiste na revelação de novos intervenientes na formação e padronização do osso, utilizando um sistema inovador, a barbatana caudal do peixezebra em regeneração. A constante avaliação de perfis mineralogénicos e de fenótipos de padronização dos raios em regeneração da barbatana caudal foi essencial durante todo o trabalho, de modo a concretizar os objetivos globais propostos. Neste sentido, foi inicialmente desenvolvido um vasto conjunto de metodologias laboratoriais e de análise de imagem, necessárias à visualização e ao seguimento da formação óssea. Foi primeiro desenvolvida uma metodologia para coloração vital do osso de peixe-zebra, baseada em microscopia de fluorescência e recorrendo a concentrações baixas e não tóxicas de vermelho de alizarina S (ARS). Esta metodologia, otimizada em larvas e posteriormente aplicada em barbatanas caudais em regeneração, permitiu seguir detalhadamente as estruturas ósseas mineralizadas ou em mineralização nas barbatanas e mostrou ser particularmente vantajosa em combinação com outros fluorocromos, como a proteína verde fluorescente (GFP). Efetuou-se, então, uma caracterização cronológica detalhada dos principais eventos estruturais durante a regeneração dos raios da barbatana (i.e. início de mineralização, segmentação e bifurcação), essencial para avaliar fenótipos relacionados com os tempos e padrões de formação óssea. Foram ainda desenvolvidos e otimizados vários procedimentos analíticos para avaliar as performances regenerativas e mineralogénicas de um modo preciso, testados em amostras fixadas e em espécimes vivos, e aplicados com sucesso em peixes expostos a ácido retinóico e varfarina. As ferramentas, os procedimentos e as metodologias desenvolvidas e estandardizadas no contexto deste trabalho, beneficiarão certamente a investigação nas áreas da medicina regenerativa, engenharia de tecidos e biologia do osso. Em última análise, contribuem para o estabelecimento do peixe-zebra como uma ferramenta valiosa para a descoberta de fármacos, em particular para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças ósseas. De modo a obter evidências relativamente a mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação e padronização dos raios da barbatana caudal, foi analisado os transcriptoma de regenerados em estádios característicos de formação do blastema e proliferação celular (24 hpa – horas pós amputação), assim como de crescimento regenerativo e formação/padronização dos raios (72 hpa; início da bifurcação). De entre os genes associados a desenvolvimento esquelético, calca surgiu como o mRNA mais sobre-expresso durante a formação e padronização dos raios. Considerando a função da Calcitonina (uma hormona hipocalcémica secretada, codificada pelo gene calca) na inibição da atividade e diferenciação osteoclástica foi gerada a hipótese de que os osteoclastos estariam envolvidos na padronização dos raios ósseos. De entre os processos de padronização que ocorrem durante a morfogénese dos raios da barbatana, a bifurcação é, provavelmente, um dos que menos se conhece. Sabe-se que o Sonic hedgehog (Shh) é um regulador essencial deste processo, no entanto, é insuficiente para estabelecer a posição final da bifurcação. Uma caracterização pormenorizada do processo de bifurcação permitiu a definição de três fases distintas, mas complementares, durante este processo. Uma primeira fase – fase de divisão – é caracterizada pela divisão do raio induzida por sinalização morfogenética, como Shh. Uma segunda fase – fase de fusão – é caracterizada pela fusão dos raios segregados, mediada por osteoblastos. Finalmente, uma terceira fase – fase de determinação – é caracterizada por atividade anti-fusão para determinar a posição final da bifurcação do raio, de forma precisa. Os dados disponíveis (incluindo os descritos neste trabalho) sugerem que esta última fase de determinação poderá ser mediada por osteoclastos. Neste sentido, mostrámos a presença de osteoclastos e da enzima Trap, por eles secretada, nos locais de bifurcação. Demonstrámos também que a inibição da atividade osteoclástica com calcitonina de salmão é acompanhada por uma inibição do processo de bifurcação sem, no entanto, ser acompanhada por alterações relativas aos domínios de expressão de shh. Este trabalho aponta ainda para uma regulação endógena dos osteoclastos pela Calcitonina, durante o processo de bifurcação. Neste contexto, dados obtidos com a linha transgénica Tg(calca:Gal4), gerada no âmbito do presente trabalho, cruzada com Tg(UAS:GFP) sugerem que a Calcitonina poderá auto-regular os progenitores de osteoclastos, mantendo-os num estado indiferenciado. De acordo com esta hipótese, estas células progenitoras diferenciar-se-ão após inibição espacialmente controlada dos mecanismos da Calcitonina, regulando o recrutamento de osteoclastos maturos para os locais de bifurcação. Para além de gerar evidências acerca do papel dos osteoclastos e da Calcitonina na regulação do processo de bifurcação dos raios, este trabalho revelou um novo papel autócrino/parácrino da Calcitonina, para além da sua atividade endócrina clássica. Apesar das diferenças celulares intrínsecas entre o osso de peixe e mamíferos, as respostas adaptativas dos peixes teleósteos a alterações na carga mecânica são comparáveis às dos mamíferos, pelo que foi gerada a hipótese de que o osso em regeneração teria também a capacidade de responder e adaptar-se quando submetido a estímulos mecânicos. No seguimento do novo papel proposto para os osteoclastos durante a bifurcação dos raios, e de modo a obter dados adicionais relativamente os mecanismos de formação e padronização óssea durante a regeneração da barbatana caudal, foi desenvolvido um modelo de regeneração sob efeito de carga mecânica, baseado em treino de natação. Como descrito noutros modelos, foi observado um aumento na formação óssea durante a regeneração sob treino de natação, acompanhada de uma proximalização e/ou aceleração da bifurcação dos raios. Observou-se, simultaneamente, um aumento dos domínios de expressão de shh, um aumento do número de osteoblastos em estádios tardios e uma diminuição da atividade osteoclástica (sendo que o decréscimo da atividade osteoclástica observado nos locais de bifurcação é provavelmente devido a uma aceleração de todo o processo). Estes resultados sugerem que os efeitos do treino de natação na bifurcação dos raios poderão ser consequentes de um impacto geral nas fases de divisão, fusão e determinação, acima caracterizados. Para além dos efeitos morfológicos aqui descritos, o treino de natação permitiu ainda identificar novos potenciais intervenientes na formação e padronização dos raios da barbatana, como o ddit4 (possível regulador da osteoblastogénese e osteoclastogénese) e o btg2 (um possível interveniente no processo de regressão do tecido interdigital nos tetrápodes). Foi ainda proposto um provável envolvimento do gene legumain e de vários genes legumain-like no controlo da atividade osteoclástica durante a padronização dos raios, possivelmente através de uma relação neuronal-óssea mediada por mecanismos de mecano-transdução. Para além de demonstrar que o sistema de treino de natação é vantajoso para modelar os mecanismos de formação óssea em contextos de doença e regeneração, estes dados representam as primeiras descrições fenotípicas do osso em regeneração em função das condições biomecânicas. A maioria dos dados apresentados neste trabalho sugerem uma ligação morfológica e mecanística entre a bifurcação dos raios da barbatana e a especificação dos dígitos dos tetrápodes. De facto, para além de intermediários da via de sinalização Hedgehog, observou-se uma sobre-expressão de outros genes cruciais para a padronização dos membros e especificação dos dígitos (e.g. genes hox) durante a formação e padronização dos raios. Os dados de RNA-Seq mostraram ainda que os genes diferencialmente expressos entre os dois estádios analisados, estavam associados a várias doenças ósseas humanas, muitas das quais relacionadas com malformações dos dígitos, como a sindactilia (e.g. fusão digital). Os resultados deste trabalho evidenciam uma possível colaboração dos osteoclastos com outros tipos celulares (e.g. macrófagos) na remodelação do tecido inter-raio durante o processo de bifurcação, de modo comparável ao processo de regressão inter-digital nos membros de tetrápodes. Este trabalho proporcionou avanços técnicos valiosos para o estudo da regeneração óssea em peixe-zebra e permitiu a identificação de novos intervenientes na formação e padronização (i.e. bifurcação) dos raios ósseos da barbatana caudal. De um modo global, propõe-se a bifurcação dos raios da barbatana caudal do peixe-zebra como um potencial modelo para a especificação dos dígitos dos tetrápodes e doenças associadas.
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Keywords
Sistema de regeneração da barbatana caudal do peixe-zebra Coloração com vermelho de alizarina S Osteoclastos Bifurcação dos raios Calcitonina Mecanofisiologia