Human neurons derived from induced pluripotent stem cells: a platform for screening compounds to treat Gaucher´s disease and Parkinson's disease

Matias, Dino Emanuel Santos

http://hdl.handle.net/10400.1/16730

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Authors

Matias, Dino Emanuel Santos

Advisor(s)

Tiscornia, Gustavo

Abstract(s)

A doença de Gaucher (Gaucher disease – GD) é a doença lisossomal com maior taxa incidência em todo o mundo (Mistry et al., 2017). As doenças de armazenamento lisossomal, são um grupo de doenças metabólicas hereditárias caracterizadas pela redução de atividade ao longo de uma via metabólica, levando à acumulação de um ou mais dos seus substratos, e consequente desregulação celular. GD é causada por níveis reduzidos de atividade da hidrolase β-glucocerebrosidase (GCase), o que pode ocorrer por mutações no centro ativo, alterações no processamento, no ativador ou nos transportadores. A doença transmite-se quase exclusivamente de por transmissão autossómica recessiva de mutações no gene da GCase, GBA1. Ainda que raro, alguns casos de GD causados por mutações no gene PSAP, que codifica para o cofator da GCase, Saposin C (Kang et al., 2018). Até à data, mais de 300 mutações GBA1 foram descritas como causadoras de GD e, apesar da grande maioria poupar o centro ativo da enzima, tendem a alterar drasticamente a estrutura tridimensional, estabilidade e transporte da GCase (Dvir et al., 2003; Manoj Kumar Pandey, Rani, Zhang, Setchell, & Grabowski, 2012). Produção de GCase com uma estrutura tridimensional errada ativa o sistema de controlo de qualidade do reticulo endoplasmático que, através do uso de chaperones do sistema UPR (Unfolded Protein Response), tenta promover uma conformação correta. Após vários ciclos falhados de remodelação molecular, o UPR despoleta apoptose através da via mitocondrial (Bendikov-Bar & Horowitz, 2012; Grabowski, Zimran, & Ida, 2015).Para além da pressão exercida sob o Retículo Endoplasmático (ER), a baixa atividade da GCase leva a uma acumulação intralisossomal de substratos glucosilceramida (GlcCer) e glucosilsesfingosina (Awad et al., 2015; Choi et al., 2011). Apesar desta ser expressa ubiquamente, devido à sua natureza e função fisiológica com altos níveis de remodelação e atividade lisossomal, as células do sistema reticuloendotelial e neuronal são primordialmente afetadas. Nos macrófagos, GlcCer acumula-se em vesículas que ocupam grande parte do citoplasma, formando as características células de Gaucher, identificáveis por histologia, que mantêm um estado de inflamação sistémica constante (Hollak, van Weely, van Oers, & Aerts, 1994; Klein & Futerman, 2013). Neurónios, por outro lado, são especialmente sensíveis a baixos níveis de GCase devido à alta taxa de processamento de gangliósidos por processos associados à sinapse, entrando em apoptose e gerando um ciclo de inflamação e morte neuronal (Grabowski, 2008; Mencarelli & Martinez–Martinez, 2013). O modo como cada mutação ou genótipo afeta estes dois tipos celulares explica a panóplia de sintomas que são geralmente associados a GD e são comumente divididos em sintomas viscerais ou sistémicos que afetam fígado, baço, pulmões e ossos, e sintomas neurológicos, com afeção de áreas específicas do cérebro e sistema nervoso central. Apesar de algumas mutações apresentarem um fenótipo predominantemente sistémico ou neurológico, a vasta maioria das mutações, não está diretamente associada a um padrão sintomático ou severidade. Atualmente, num contexto académico reconhece-se que a dispersão dos sintomas e sua severidade formam um gradiente, das formas neurológicas congénitas mais agudas até formas mais leves de envolvimento somático exclusivamente detetadas numa fase mais tardia de vida ou que não são detetadas de todo (Aureli et al., 2012). No contexto clínico, a sintomatologia é classificada em três tipos de acordo com as necessidades terapêuticas e prognóstico: tipo 1 (não neuropático); tipo 2 (neuropático agudo); e tipo 3 (neuropático crónico). As manifestações sistémicas mais comuns incluem inflamação generalizada, hepatomegalia, esplenomegalia, pancitopenia e osteoporose, e tendem a estar presentes em todos os tipos de GD ao passo que as manifestações neurológicas incluem espasticidade, nistagmo, défice cognitivo e neurodegeneração e manifestamse nos tipos 2 e 3 (Butler, 2001; McNeill et al., 2012).GD tipo 1 é a forma mais frequente da doença, afetando mais de 90% dos pacientes, ao passo que o tipo 2 é a forma mais severa, apresentando um prognóstico muito reservado com uma degeneração neurológica rápida e acentuada, resultando numa esperança média de vida de 9 meses. O tipo 3 encontra-se entre o tipo 1 e 2 em termos de severidade, apresentando tanto sintomas viscerais como neurológicos crónicos (Ozlem Goker-Alpan et al., 2003). Ainda que não haja cura para GD, existem presentemente várias alternativas de tratamento e gestão de sintomas, dependendo da sintomatologia e apresentação fenotípica da doença. O primeiro tratamento desenvolvido foi o transplante de medula óssea (bone marrow transplantation - BMT) através da transfusão de progenitores hematopoiéticos de dadores saudáveis. Se feito correta e precocemente, BMT pode prevenir tanto manifestações viscerais como neurológicas da doença, no entanto este efeito terapêutico é perdido com a idade (Platt & Jeyakumar, 2008). Para além disso BMT não tem efeito nas formas neuropatológicas mais agudas de GD tipo 2 pela rápida progressão e deterioração (Platt & Jeyakumar, 2008; Shawky & Elsayed, 2016). Durante vários anos, a única alternativa a BMT foi, a suplementação endovenosa de GCase, num sistema terapêutico de substituição enzimática (enzyme replacement therapies – ERT). Terapias ERT são ainda a primeira linha de tratamento de GD, com melhorias como a marcação de GCase com resíduos de manose para facilitar a sua captação por macrófagos (Grabowski, 2008; McEachern et al., 2007). No entanto, apesar de aliviar a grande maioria dos sintomas sistémicos, uma vez que GCase não atravessa a barreira hematoencefálica, ERT não tem qualquer efeito nas manifestações neuronais da doença (R Kornfeld & Kornfeld, 1985). A classe de fármacos mais recente na prática clínica, aposta numa diminuição da acumulação de GlcCer através da inibição a montante da via catabólica, numa abordagem denominada terapia de redução de substrato (substrate reduction therapy - SRT). Esta abordagem tem foco na inibição da glucosilceramida sintetase, reduzindo a concentração intracelular dos seus produtos, glucose e ceramida (Rao Vunnam & Radin, 1980). Apesar de apresentarem um potencial terapêutico mais baixo do que ERT para sintomas viscerais, as terapias por SRT, ao serem baseadas em pequenas moléculas glicomiméticas são capazes de atravessar a barreira hematoencefálica e aliviar os sintomas neuronais. Contudo, apesar do baixo custo, os efeitos secundários e o baixo efeito terapêutico relegam SRT para uma segunda linha de tratamento. Inspirados na terapia SRT, uma nova classe de fármacos tem vindo a ganhar a atenção da comunidade científica: chaperones farmacológicas (pharmacological chaperones – PC). Estes compostos atuam como inibidores reversíveis da GCase e, ligando-se ao centro ativo da enzima melhoram a sua conformação, ajudando-a a iludir o Sistema de Controlo de Qualidade do Retículo Endoplasmático, aumentando a quantidade de Gcase e permitindo que exerça a sua função com a capacidade hidrolítica remanescente. Recentemente, investigação e desenvolvimento de novas abordagens para compensar ou suplementar défices de atividade de GCase no sistema nervoso central têm ganho novo fôlego devido a uma série de associações entre mutações em GBA1 e desenvolvimento de patologias neurológicas degenerativas. Apesar de GD tipo 1 ser, por definição, ausente de qualquer manifestação neurológica ao longo dos anos, uma série de casos esporádicos de manifestações semelhantes à sintomatologia clássica da doença de Parkinson (PD) começaram a ser notadas. Apesar de inicialmente episódica, a incidência mais elevada de bradicinesia, demência, défice cognitivo, hiposmia e depressão levaram a que fossem feitos os primeiros estudos genéticos de associação ente PD e GD (Sidransky & Lopez, 2012; Yang, Lee, Lee, Kim, & Lee, 2013). Estudos recentes apontam para uma sobre representação de pacientes PD com mutações GBA1, 5 a 7 vezes superior quando comparado a um grupo controlo, com uma idade média no momento do diagnóstico 4 a 6 anos inferior (Aharon-Peretz , Rosenbaum , & Gershoni-Baruch 2004; Sidransky & Hart, 2012; Toft, Pielsticker, Ross, Aasly, & Farrer, 2006). No entanto, apesar da correlação estatística, o mecanismo subjacente à relação entre GCase e α-sinucleína ainda é pouco claro. O primeiro modelo mecanístico foi desenvolvido em Mazzulli et al em 2011, no qual é proposta a existência de uma relação inversamente proporcional entre a atividade de GCase e os níveis de α-sinucleína, na qual reduzida atividade de GCase resulta em elevados níveis de α-sinucleína, que, por sua vez, diminuem o transporte de GCase para o lisossoma, reduzindo os níveis de hidrólise e aumentando o numero de fibrilas de α-sinucleína (Mazzulli et al., 2011). GCase tornou-se, deste modo, não apenas o alvo terapêutico para GD, mas também para PD (Aflaki et al., 2016). O presente trabalho teve como objetivos: I) Estabelecer um modelo neuronal in vitro a partir de iPSc para os genótipos de GD tipo 2 L444P/L444P (clone A), L444P/P415R (clone B), G325R/C342G (clone C), L444P/G202R (clone D), e controlo (wild type - WT), e corroborar a relação entre a atividade de GCase e os níveis de α-sinucleína; II) testar um grupo de 12 chaperones farmacológicas em neurónios de pacientes GD2 e caracterizá-los quanto ao seu efeito na Gcase, quer na quantidade de proteína, quer na sua atividade; III) testar o efeito de retroalimentação positiva proposto por Mazzulli et al., através da medição dos níveis de α-sinucleína e da relação destes com a atividade de GCase e quantidade de proteína (Mazzulli et al., 2011). Para tal, fibroblastos de 3 genótipos GD tipo 2 (Clones A, B e C) foram reprogramados ao estado de pluripotência através de transdução e expressão dos fatores de reprogramação Oct4, Sox2, Klf4 e CMyc (OSKM) (Takahashi et al., 2007). Um controlo sem mutação GBA1 (WT) e um outro genótipo GD tipo 2 (clone D) previamente reprogramados e testados foram também usados durante este trabalho. O conjunto dos clones iPSc WT, A, B, C e, D foram então diferenciados em neurónios através de um protocolo de diferenciação em camada única adaptado e otimizado por nós. Culturas confluentes de neurónios foram tratadas com um conjunto de chaperones pertencentes a iminoaçucares, piperidinas monocíclicas (MTD131, TMB69, TMB65 e TMB84); piperidinas bicíclicas (MTD106, MG174, MTD132 e RV21); e nortropanos (MG235, CVI62, DW43 e DW45), com os seguintes resultados: I) No modelo estabelecido, os níveis de GCase estão de acordo com o que foi descrito para neurónios GD2, com níveis de atividade hidrolítica inferiores 20% aos observados para o controlo. Simultaneamente, com níveis reduzidos de GCase, estes clones apresentavam níveis aumentados de α-sinucleína. II) Ainda que a maioria dos compostos tenha afetado os níveis de proteína GCase, o efeito foi pouco consistente nos diferentes genótipos, apresentando variações consideráveis consoante as mutações GBA1 pressentes. Não obstante, alguns compostos demonstraram um efeito potencialmente terapêutico num ou mais genótipos: Clone A (L444P/L444P) apresentou um aumento dos níveis proteicos de GCase e redução dos níveis de α-sinucleína na presença dos chaperones TMB69, TMB65, MTD132, RV21, MG235 e CVI62; Clone B (L444P/P415R), aumentou os níveis proteicos de GCase por um fator de 3 quando tratado com TBM69, com concomitante redução de α-sinucleína em 70%. Neste mesmo genótipo, TMB65, reduziu α-sinucleína em 90% apesar de não ter nenhum efeito observável na GCase; para o Clone C (G325R/C342G), o chaperone MTD106 elevou a atividade de GCase e reduziu em 50% os níveis de α-sinucleína ; relativamente ao Clone D (L444P/G202R), apesar de nenhum dos compostos reduzir efetivamente os níveis de α-sinucleína, um aumento da atividade de GCase foi alcançado quando tratado com MTD106. III) Apesar do efeito positivo de alguns chaperones seja na quantidade ou atividade de GCase, como na redução dos níveis de α-sinucleína, esse efeito não é consistente. Esta observação pode ser causada por vários fenómenos como o efeito inibitório do composto, a afinidade e resistência de alguns dos compostos usados aos métodos de extração e desnaturação usados. Novos estudos serão necessários de modo a clarificar a interação entre os diferentes alelos de GD e chaperones de modo a garantir não só um aumento da atividade de GCase, mas também a segurança quanto aos níveis de α- sinucleína.

Gaucher Disease (GD) is the most common lysosomal storage disease. It is caused by mutations in GBA1 which lead to dysfunctional β-glucocerebrosidase (GCase) activity and an accumulation of its substrates, glucosylceramide and glucosylsphingosine. Reticuloendothelial system cells and neurons are especially affected by high glucosylceramide levels, generating multiple symptoms. According to the distribution and severity of the symptoms, and degree of neuronal involvement, GD can be classified as systemic (GD1), severe acute neuropathic (GD2) or chronic neuropathic (GD3). Presently, none of the available therapies are effective at alleviating neuronopathic forms of the disease. Recent studies have pointed to GBA1 mutations as the most frequent genetic risk factor for Parkinson Disease. In 2011, Mazzulli et al. proposed a feedforward mechanistic loop model explaining the inverse correlation between GCase activity and α-syn levels. In the present work, we developed an optimized differentiation protocol to test iPSc derived neurons from four GD2 genotypes (L444P/L444P, L444P/P415R, G325R/C342G and L444P/G202R). Each clone was treated with a set of 12 chaperone compounds regarding their effect on GCase protein levels, and activity. Simultaneously, α-syn levels were measured for each sample to test Mazzulli’s hypothesis. Our results identified some compounds which effectively enhanced GCase and decreased α-syn, which can be considered and explored as novel therapies for GD and PD. Our results indicate that chaperone treatment does not affect GCase levels/activity and the relation with α-syn levels in a way consistent with Mazzulli’s proposed model. This might be due to the multiple variable at play in our experimental system and suggests the need for follow-up studies.