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Publication
Cited2 in cardiac development: an inside and outside job
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Despite the remarkable knowledge acquired in the formation of the heart during
embryonic development and the molecular mechanisms involved in heart function and
physiology, there is no efficient way to prevent adult heart disease and congenital heart disease
(CHD). The transcriptional modulator Cited2 is required for normal embryogenesis of mice
and humans, particularly for heart development. Indeed, mouse lacking Cited2 alleles die in
utero displaying many cardiovascular defects, and mutations in human CITED2 have long been
associated with CHD. However, the exact role and the molecular mechanisms involving
Cited2 during these processes are largely unknown.
Using mouse Embryonic Stem Cells (ESC) as a model system, we have established that
the depletion of Cited2 at the onset of differentiation resulted in a decline of ESC ability to
generate cardiac cells. These cardiogenic defects in Cited2-depleted cells were rescued by
treatment with a recombinant CITED2 protein.
To further investigate the mechanisms caused by the loss of Cited2 in pluripotency and
differentiation, we compared the gene expression profiles of control cells and Cited2-depleted
cells upon differentiation. We determined that loss of Cited2 expression delays the expression
of early mesoderm transcription factors and cardiopoietic factors.
We found that the secretome of Cited2 overexpressing ESC is enough to restore the
emergence of beating colonies in Cited2 depleted cells, upon differentiation. We identified
WNT5a and WNT11 as two of the proteins enriched in the Conditioned Medium and crucial
for rescuing cardiomyocyte differentiation defects caused by Cited2 depletion.
Our results point that Cited2 is a co-transcriptional activator of Wnt5a and Wnt11 and
that both proteins can restore cardiogenesis in Cited2-depleted cells. Additionally, using
zebrafish as a model system, we demonstrated that WNT5a and WNT11 also rescued the
development defects caused by Cited2 depletion in vivo.
Collectively, our results show that WNT5a and WNT11 rescue cardiogenic defects
caused by Cited2 depletion both in vitro, as well as in vivo.
Apesar do notável conhecimento adquirido sobre o desenvolvimento cardíaco, as doenças cardiovasculares e as doenças congénitas cardíacas (CHD), continuam a ser a principal causa de morte no mundo tanto nos adultos como em recém-nascidos. Estima-se que cerca de 1% da população mundial seja portadora de uma forma de CHD e, espera-se que este número aumente substancialmente nas próximas décadas. Um ponto crucial do desenvolvimento cardíaco é a expressão primorosamente controlada de fatores de transcrição e vias de sinalização cardíacas. Pequenos desvios na estrita expressão de fatores de transcrição e das vias de sinalização cardíacas, podem resultar num mau desenvolvimento do coração e no aparecimento de CHD, ou em casos mais extremos à morte do embrião ainda no útero. Dentro dos fatores de transcrição importantes para a formação do coração destacam-se inicialmente os genes importantes para a regulação da pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG. Após a gastrulação, as células da mesoderme começam inicialmente a expressar BRACHYURY, MIXL1 e EOMES, e mais tarde o gene da mesoderme cardiaca MESP1. Por último, os progenitores cardíacos começam a expressar os fatores de transcrição cardíacos GATA4, NKX2.5, HAND2, TBX5, MEF2C e ISL1. As principais vias de sinalização cardíacas são a ACTIVIN/NODAL e as BMP, ambas pertencentes à via TGFβ, a via canónica e não canónica da WNT e por último, a via FGF. Um ótimo modelo, in vitro, para se estudar os mecanismos moleculares, responsáveis pela formação do coração, são as células estaminais embrionárias (ESC). Algumas das características que tornam as ESC um bom modelo para estudar o desenvolvimento cardíaco são, o fato de se dividirem indefinidamente e de se diferenciarem em todas as células do adulto, após o correto estímulo, incluindo cardiomiócitos com a capacidade de produzirem focos de contração. O fator de transcrição Cited2, é importante para o desenvolvimento cardíaco, uma vez que a remoção de ambos os alelos de Cited2 no ratinho é letal ainda no útero, enquanto que mutações pontuais na proteína CITED2 foram previamente associadas com o aparecimento de CHD. No entanto, a função de CITED2 no desenvolvimento cardíaco e no aparecimento das CHD é ainda bastante desconhecida. Como tal, o objetivo deste trabalho foi estudar o papel de Cited2 durante o processo de diferenciação cardíaco de ESC. Para estudar o efeito de depleção de Cited2, durante a diferenciação cardíaca, utilizamos no laboratório uma linha de ESC com “Knock-out” condicional de Cited2, que quando suplementado com 4-hydroxytamoxifen, no meio de cultura, resulta na excisão e depleção de Cited2. Começamos por ver que Cited2 é expresso ao longo do processo de diferenciação cardíaca, sendo a sua expressão mínima no dia 2 de diferenciação. De seguida, vimos que a depleção de Cited2, no início da diferenciação, reduz a capacidade das ESC de se diferenciarem em cardiomiócitos. Para demonstrar que os defeitos cardíacos eram causados pela falta de Cited2, tratámos as ESC com uma proteína recombinante CITED2. Os resultados obtidos indicam que esta proteína reverte os defeitos cardíacos quando adicionado no segundo dia de diferenciação. Para perceber melhor os mecanismos subjacentes à perda de função de CITED2, comparámos o perfil genético de células controlo (com Cited2) e células sem Cited2 no início da diferenciação. Neste sentido, realizámos uma análise de “microarrays”, e observámos que as células sem Cited2 têm vários genes, importantes para a diferenciação em endoderme e mesoderme desregulados. Comprovámos que a depleção de Cited2 atrasa a expressão de fatores de transcrição da mesoderme (Brachyury, Mixl1) e da mesoderme cardíaca (Mesp1 e Eomes). Observámos também, que a depleção de Cited2 inibe a expressão de várias vias de sinalização cardíacas, o que nos fez colocar a hipótese de que a deficiência cardíaca, causada pela falta de Cited2, resultaria da desregulação da expressão de proteínas extracelulares. Para o estudo de proteínas extracelulares considerámos o uso de Meio Condicionado (CM), ou seja, recorremos ao meio de cultura que contém, entre vários componentes, proteínas secretadas pelas células (secretoma). Portanto, através do secretoma de ESC, que sobre expressam Cited2, observámos que este é suficiente para recuperar os defeitos cardíacos causados pela falta de Cited2. Vimos também que o CM é crítico para a correta expressão do fator de transcrição Brachyury. Ao imunoprecipitarmos o CM contra WNT5a e WNT11, seguido de um Western Blot, identificámos que as proteínas WNT5a e WNT11 se encontravam enriquecidas no CM proveniente das células que sobre expressavam Cited2. Vimos também que estas duas proteínas eram críticas no CM, uma vez que quando as depletavámos, víamos que o CM perdia a sua capacidade de recuperar os defeitos cardiovasculares das células sem Cited2. A WNT5a e a WNT11 são duas proteínas pertencentes à via não canónica da WNT e que cooperam para promover o desenvolvimento cardíaco, mais propriamente, para promover a formação do campo secundário cardíaco. Os nossos resultados, in vitro, apontam para que Cited2 seja um co-ativador transcricional do Wnt5a e do Wnt11. Mostrámos, que existe uma sinergia entre a WNT5a e WNT11 para corrigir os defeitos cardíacos causados pela falta de Cited2 in vitro, não só em termos de diferenciação celular e surgimento de focos de contração, mas também para a correta expressão de fatores de transcrição da mesoderme e da mesoderme cardiaca. Adicionalmente, para estudar a perda de função de Cited2 in vivo, estabelecemos um sistema de “Knockdown” de Cited2 no peixe zebra (Danio renio). Cited2, é um gene conservado entre os vertebrados e, portanto, tal como acontece nos mamíferos, Cited2 é necessário para o correto desenvolvimento do peixe zebra. Através das experiências realizadas, vimos que a falta de Cited2 atrasa o desenvolvimento dos embriões às 24 horas pós fertilização (hpf), reduz o número de batimentos médio por minuto às 48 hpf e, causa letalidade e o surgimento de defeitos cardíacos em embriões de peixe zebra às 72hpf. Demonstrámos que estes defeitos eram específicos de Cited2, uma vez que conseguimos recuperar a maioria dos defeitos causados pela falta de Cited2, quando usámos a proteína recombinante CITED2. Por último, como acontece in vitro, a combinação da WNT5a e da WNT11 é capaz de compensar a falta de Cited2, também, in vivo. Em suma, os nossos resultados indicam que a WNT5a e a WNT11 corrigem, in vitro e in vivo, os defeitos cardíacos causados pela perda de Cited2, sendo o nosso objetivo, no futuro, desenvolver uma nova opção terapêutica para reduzir o número de pacientes com CHD.
Apesar do notável conhecimento adquirido sobre o desenvolvimento cardíaco, as doenças cardiovasculares e as doenças congénitas cardíacas (CHD), continuam a ser a principal causa de morte no mundo tanto nos adultos como em recém-nascidos. Estima-se que cerca de 1% da população mundial seja portadora de uma forma de CHD e, espera-se que este número aumente substancialmente nas próximas décadas. Um ponto crucial do desenvolvimento cardíaco é a expressão primorosamente controlada de fatores de transcrição e vias de sinalização cardíacas. Pequenos desvios na estrita expressão de fatores de transcrição e das vias de sinalização cardíacas, podem resultar num mau desenvolvimento do coração e no aparecimento de CHD, ou em casos mais extremos à morte do embrião ainda no útero. Dentro dos fatores de transcrição importantes para a formação do coração destacam-se inicialmente os genes importantes para a regulação da pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG. Após a gastrulação, as células da mesoderme começam inicialmente a expressar BRACHYURY, MIXL1 e EOMES, e mais tarde o gene da mesoderme cardiaca MESP1. Por último, os progenitores cardíacos começam a expressar os fatores de transcrição cardíacos GATA4, NKX2.5, HAND2, TBX5, MEF2C e ISL1. As principais vias de sinalização cardíacas são a ACTIVIN/NODAL e as BMP, ambas pertencentes à via TGFβ, a via canónica e não canónica da WNT e por último, a via FGF. Um ótimo modelo, in vitro, para se estudar os mecanismos moleculares, responsáveis pela formação do coração, são as células estaminais embrionárias (ESC). Algumas das características que tornam as ESC um bom modelo para estudar o desenvolvimento cardíaco são, o fato de se dividirem indefinidamente e de se diferenciarem em todas as células do adulto, após o correto estímulo, incluindo cardiomiócitos com a capacidade de produzirem focos de contração. O fator de transcrição Cited2, é importante para o desenvolvimento cardíaco, uma vez que a remoção de ambos os alelos de Cited2 no ratinho é letal ainda no útero, enquanto que mutações pontuais na proteína CITED2 foram previamente associadas com o aparecimento de CHD. No entanto, a função de CITED2 no desenvolvimento cardíaco e no aparecimento das CHD é ainda bastante desconhecida. Como tal, o objetivo deste trabalho foi estudar o papel de Cited2 durante o processo de diferenciação cardíaco de ESC. Para estudar o efeito de depleção de Cited2, durante a diferenciação cardíaca, utilizamos no laboratório uma linha de ESC com “Knock-out” condicional de Cited2, que quando suplementado com 4-hydroxytamoxifen, no meio de cultura, resulta na excisão e depleção de Cited2. Começamos por ver que Cited2 é expresso ao longo do processo de diferenciação cardíaca, sendo a sua expressão mínima no dia 2 de diferenciação. De seguida, vimos que a depleção de Cited2, no início da diferenciação, reduz a capacidade das ESC de se diferenciarem em cardiomiócitos. Para demonstrar que os defeitos cardíacos eram causados pela falta de Cited2, tratámos as ESC com uma proteína recombinante CITED2. Os resultados obtidos indicam que esta proteína reverte os defeitos cardíacos quando adicionado no segundo dia de diferenciação. Para perceber melhor os mecanismos subjacentes à perda de função de CITED2, comparámos o perfil genético de células controlo (com Cited2) e células sem Cited2 no início da diferenciação. Neste sentido, realizámos uma análise de “microarrays”, e observámos que as células sem Cited2 têm vários genes, importantes para a diferenciação em endoderme e mesoderme desregulados. Comprovámos que a depleção de Cited2 atrasa a expressão de fatores de transcrição da mesoderme (Brachyury, Mixl1) e da mesoderme cardíaca (Mesp1 e Eomes). Observámos também, que a depleção de Cited2 inibe a expressão de várias vias de sinalização cardíacas, o que nos fez colocar a hipótese de que a deficiência cardíaca, causada pela falta de Cited2, resultaria da desregulação da expressão de proteínas extracelulares. Para o estudo de proteínas extracelulares considerámos o uso de Meio Condicionado (CM), ou seja, recorremos ao meio de cultura que contém, entre vários componentes, proteínas secretadas pelas células (secretoma). Portanto, através do secretoma de ESC, que sobre expressam Cited2, observámos que este é suficiente para recuperar os defeitos cardíacos causados pela falta de Cited2. Vimos também que o CM é crítico para a correta expressão do fator de transcrição Brachyury. Ao imunoprecipitarmos o CM contra WNT5a e WNT11, seguido de um Western Blot, identificámos que as proteínas WNT5a e WNT11 se encontravam enriquecidas no CM proveniente das células que sobre expressavam Cited2. Vimos também que estas duas proteínas eram críticas no CM, uma vez que quando as depletavámos, víamos que o CM perdia a sua capacidade de recuperar os defeitos cardiovasculares das células sem Cited2. A WNT5a e a WNT11 são duas proteínas pertencentes à via não canónica da WNT e que cooperam para promover o desenvolvimento cardíaco, mais propriamente, para promover a formação do campo secundário cardíaco. Os nossos resultados, in vitro, apontam para que Cited2 seja um co-ativador transcricional do Wnt5a e do Wnt11. Mostrámos, que existe uma sinergia entre a WNT5a e WNT11 para corrigir os defeitos cardíacos causados pela falta de Cited2 in vitro, não só em termos de diferenciação celular e surgimento de focos de contração, mas também para a correta expressão de fatores de transcrição da mesoderme e da mesoderme cardiaca. Adicionalmente, para estudar a perda de função de Cited2 in vivo, estabelecemos um sistema de “Knockdown” de Cited2 no peixe zebra (Danio renio). Cited2, é um gene conservado entre os vertebrados e, portanto, tal como acontece nos mamíferos, Cited2 é necessário para o correto desenvolvimento do peixe zebra. Através das experiências realizadas, vimos que a falta de Cited2 atrasa o desenvolvimento dos embriões às 24 horas pós fertilização (hpf), reduz o número de batimentos médio por minuto às 48 hpf e, causa letalidade e o surgimento de defeitos cardíacos em embriões de peixe zebra às 72hpf. Demonstrámos que estes defeitos eram específicos de Cited2, uma vez que conseguimos recuperar a maioria dos defeitos causados pela falta de Cited2, quando usámos a proteína recombinante CITED2. Por último, como acontece in vitro, a combinação da WNT5a e da WNT11 é capaz de compensar a falta de Cited2, também, in vivo. Em suma, os nossos resultados indicam que a WNT5a e a WNT11 corrigem, in vitro e in vivo, os defeitos cardíacos causados pela perda de Cited2, sendo o nosso objetivo, no futuro, desenvolver uma nova opção terapêutica para reduzir o número de pacientes com CHD.
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Keywords
CITED2 WNT5a WNT11 Defeitos Cardíacos Células estaminais