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Investigating the expression of genes and proteins in Glioblastoma during hypoxia

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Abstract(s)

Glioblastoma multiforme (GBM), grade IV Astrocytoma, is the most common and deadly form of brain cancer. Despite the low incidence rate (3.2 per 100.000 people), patient’s median survival is only 14 months. Notwithstanding all new diagnostic tools, GBM remains a therapeutic challenge, being extremely difficult to prevent recurrence. Therefore, it is essential to conduct research in order to understand the molecular pathways in the core of GBM aggressiveness and swift evolution. GBM is often characterized by hypoxic regions where oxygen levels are extremely low. As a natural consequence of tumour growth and expansion, some areas of the tumour become distanced from the blood vessels and consequently, from the oxygen supply. In such a critical environment, cells activate pro-survival and malignancy mechanisms such as the metabolic switch, invasion and angiogenesis. Hence we investigated the expression of genes featuring these survival mechanisms and identified a panel of hypoxia-driven-malignancy markers. To conduct this study, two GBM patient´s biopsy-derived cell lines (UP-029 and SEBTA-023) were used and cultured under hypoxic conditions for a selected set of time-points (time-course). To characterize the hypoxic response of these cells, hypoxia profiler microarrays were ran for normoxia, 6 and 48 hours of hypoxia (1% O2). Once identified the induced and repressed genes, these were analyzed and validated through qRT-PCR assays. Finally, western-blot analysis was performed to detect target proteins and correlate with the previously obtained gene expression data. Our study validated ANGPTL4, PIGF, VEGFA, GLUT1, PFKB4, PFKB3, BNIP3, DDIT4, NDRG1 and CAIX genes as relevant in GBM’s hypoxia-mediated response. We also pointed out MXI1, HNF4A genes as likely significant factors in GBM hypoxia. Furthermore, we hypothesize PFKB3 as an adaptive resistance marker in GBM and the repression of TFRC as required mechanism for GBM progression.
O Glioblastoma multiforme (GBM) é a forma mais comum e letal de cancro no sistema nervoso central. Devido às suas caraterísticas altamente invasivas e malignas, o Glioblastoma foi considerado pela World Health Organization (WHO) como um Astrocitoma grau IV. Contrariamente a outros tipos de cancro de igual grau, a capacidade de invasão do GBM é limitada ao tecido cerebral. Apesar dos avanços nas tecnologias de diagnóstico e dos constantes progressos na investigação do cancro, o tratamento do GBM é meramente paliativo. A seletividade farmacológica da barreira hemato-encefálica, a elevada heterogeneidade tumoral e influência destrutiva do tumor no tecido nervoso, refletemse na ineficiência das terapias aplicadas. Clinicamente, o GBM manifesta-se através de pressão intracranial, cefaleias e/ou défices neurológicos tais como, alterações visuais, alterações da fala, dificuldades cognitivas e até modificações na personalidade. Embora, menos frequentes, convulsões também se encontram descritas como um dos sintomas. A taxa de incidência deste tipo de carcinoma é de facto baixa, sendo que em 100000 apenas 3.2 pessoas são afetadas. Não obstante, a média de sobrevida destes pacientes é somente 14 meses. Conduzir investigações no sentido de entender os mecanismos moleculares que se encontrar subjacentes à expansão e agressividade do GBM torna-se, portanto, essencial. Uma das características mais proeminentes do GBM são as regiões hipóxicas, onde os níveis de oxigénio são extremamente baixos. Esta é uma consequência natural, derivada da expansão tumoral e do incremento da distância de difusão de oxigénio. Estabelecido um microambiente como este, crítico para a sobrevivência celular, as células tumorais ativam mecanismos de malignidade tais como “switch” metabólico, angiogénese e invasão. Desta forma as células adquirem vantagem clonal e capacidade migratória para invadirem zonas de tecido cerebral saudável. Para além do incremento da malignidade, a elevada capacidade invasiva destas células constitui um risco em termos de recorrência. De um modo geral, a hipóxia integra-se como um marcador de mau prognostico. Para este estudo, duas linhas celulares obtidas através de biópsias de pacientes com GBM (UP-029 e SEBTA-023), foram incubadas a diferentes tempos de hipóxia. Após extração de ácido ribonucleico (ARN), realizou-se um microarray de perfil de hipóxia a três amostras em diferentes condições: normóxia (controlo), 6 e 48 horas. O método do microarray baseia-se na tecnologia de reações de polimerase em cadeia e em tempo real (RT-PCR). Este, por sua vez, é um método de quantificação de expressão génica através da geração de cópias (por ciclo de PCR) a partir de um ADN molde. Isto origina uma correlação entre a quantidade inicial de cópias e a quantidade acumulada a cada ciclo. Desta maneira, foi possível quantificar a expressão génica de 84 genes previamente descritos na literatura como relacionados na resposta hipóxica em diversos tipos de cancro. Este ensaio permitiu-nos identificar em larga escala diversos marcadores de hipóxia que foram diferencialmente expressos com significância. Do painel analisado, destacaram-se os genes ANGPTL4, NDRG1, CAIX, PFKB4 e VEGFA como relevantemente induzidos tanto nas UP-029 como nas SEBTA-023. Para além destes, os genes MXI1, HNF4A e TFRC foram estabelecidos como significativamente sub-expressos durante a hipóxia nas duas linhas celulares de GBM. Continuando com a análise, estudámos através de ensaios de RT-PCR quantitativo os vários genes distinguidos acima, tal como outros apenas diferencialmente expressos numa das linhas celulares durante a hipóxia. Cada gene foi analisado em quatro condições diferentes: normóxia, 6, 24 e 48 horas de hipóxia, em pelo menos três corridas diferentes. O método de 2-ΔΔCT foi usado para calcular o fold-change de cada gene, que nos transmite a magnitude biológica da expressão de um gene relativamente a um controlo. De modo a estudar a significância estatística dos resultados, usámos Students T-test (tipo 2, cauda 2) para calcular os P-values de cada amostra. Considerámos três níveis de significância para P-values inferiores que 0.05 (*), 0.01 (**) e 0.001 (***). Desta análise de RT-PCR quantitativo, para além dos genes previamente distinguidos, também os genes PIGF, PDK1, PFKB3, BNIP3, DDIT4 e SLC16A3 foram detetados como significativamente induzidos nas linhas celulares UP-029 e SEBTA-023. Validámos, também, o gene TFRC como significativamente subexpresso durante a hipóxia. De modo a analisar a expressão de proteínas de alguns deste fatores, realizaram-se ensaios de Western-blot. Esta é uma técnica vastamente usada em laboratório que permite a identificação de proteínas específicas de uma amostra de proteína total. Este método consiste na separação de proteínas por pesos moleculares através da aplicação de voltagem. Para tal, a amostra proteica é desnaturada através de calor e posteriormente pipetada num gel de eletroforese. As proteínas (carga negativa) migram através do gel na direção do polo positivo, assim que aplicada voltagem. Desta forma, as moléculas menores migram mais rapidamente e facilmente para a base do gel que as de maior peso molecular, que ficam mais próximas do topo. Após separação e transferência para uma membrana de nitrocelulose, é possível sinalizar estas proteínas através de complexos de anticorpos e fluoróforos. Assim, pudemos detetar a expressão proteica de alguns genes de interesse em diferentes condições: normóxia, 1, 2, 3, 6, 24 e 48 horas de hipóxia. Realizou-se uma análise de expressão proteica de HIF1a para confirmar a indução da resposta hipóxica. Uma vez que é regulado a nível da proteína, foram detetadas, de facto, bandas de HIF1a durante a hipóxia , apesar de não se observarem induções significantes da expressão génica. Como CAIX, foi significativamente expresso a nível do gene, foram também realizados blots para a proteína correspondente. A proteína CAIX foi detetável nas amostras de 6, 24 e 48 horas de hipóxia, especialmente nas células SEBTA-023. A proteína EGFR, vastamente descrita em GBM, foi também analisada. Curiosamente não foi detetável nas células UP-029, mas sim nas SEBTA-023, em todas as amostras. À semelhança de EGFR, os blots das proteínas UpaR, VEGFC e S100A10 foram também analisados. As proteínas UpaR e S100A10 foram detetadas em ambas as linhas celulares, com distinção nas amostras SEBTA-023. Nas células UP-029 a baixa deteção de proteína pode-se justificar por uma activação mais tardia da expressão de factores de invasão. Curiosamente a expressão de VEGFC, detetável em ambas as linhas, diminuí em simultaneidade com o aumento de horas de hipóxia. Em suma, o nosso estudo identificou ANGPTL4, NDRG1, CAIX, PFKB4, VEGFA, PIGF, PDK1, PFKB3, PFKB4, BNIP3, CAIX, DDIT4, NDRG1 e SLC16A3 como genes significativamente induzidos e HNF4A e TFRC como genes significativamente sub-expressos em GBM. Extrapolámos, que por vezes a indução das expressões de genes e proteínas de invasão é uma resposta tardia após um período considerado crónico de hipóxia. De futuro, deveriam ser estudados tempos de hipóxia mais prolongados, como 72 e 96 horas. Sugerimos, também, PFKB3 como um provável marcador de resistência à terapia, uma vez que já se encontra descrito noutros tumores, e neste estudo foi significativamente induzido. Conjuntamente, propõe-se o TFRC como um possível fator importante no impedimento da progressão do GBM, uma vez que foi sub-expresso nas diferentes análises. Estudos relativos a estes dois genes deverão ser conduzidos no futuro, para confirmar as hipóteses acima. Seria também relevante repetir este estudo aumentando o número de linhas celulares de modo a elevar a sensibilidade da seleção de possíveis novos marcadores de invasão em hipóxia.

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Glioblastoma (GBM) Hipóxia Angiogénese Glicólise Invasão

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