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Unraveling the role of extracellular vesicles in spinocerebellar ataxia type 2 progression
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Abstract(s)
Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a neurodegenerative polyglutamine disorder caused by an aberrant expansion of the adenine-cytosine-guanine (CAG) trinucleotide in the coding region of the ATXN2 gene. This mutation results in an abnormally expanded polyglutamine tract in ataxin-2, the protein product of this gene, which promotes aggregation and the formation of inclusion bodies within the brains of SCA2 patients. Clinically, SCA2 presents as a multisystem disorder with both motor and non-motor symptoms. Neurodegeneration primarily affects the cerebellum and its neuronal pathways, leading to gait ataxia, which is the most prominent clinical feature of SCA2 and a hallmark of all SCAs. Although only certain neuroanatomical regions are initially affected, degeneration appears to spread to other brain regions as the disease progresses.
In recent years, substantial evidence has suggested that extracellular vesicles (EVs) may mediate the neuron-to-neuron transfer of aggregation-prone proteins implicated in several neurodegenerative diseases. This mechanism has been shown to induce toxicity in healthy recipient cells, potentially contributing to disease propagation.
Based on this evidence, the present study aimed to determine whether ataxin-2-loaded exosomes, a specific EV subtype, can mediate the spread of mutant ataxin-2 and induce a SCA2-like phenotype in vivo. To this end, we conducted comprehensive motor behavioral and neuropathological analyses. Our findings show that mice injected with ataxin-2-loaded exosomes exhibited gait and posture alterations consistent with progressive motor impairment and an ataxic phenotype, alongside signs of neuroinflammation, such as astrogliosis, early Purkinje cell degeneration, and ataxin-2 aggregate-like formation. This study provides new insights into the role of EVs in SCA2 progression and suggests that ataxin-2-loaded exosomes can facilitate the spread of mutant ataxin-2, contributing to SCA2 pathology in vivo.
A ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2, do inglês spinoceberellar ataxia type 2), descrita pela primeira vez em 1971, é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante, pertencente ao grupo das doenças de poliglutaminas, e é a segunda forma hereditária de ataxia mais prevalente a nível mundial. A SCA2 resulta de uma expansão anormal de trinucleotídeos CAG no gene ATXN2, que codifica a proteína ataxina-2. Esta mutação leva à produção de uma proteína com uma sequência de poliglutaminas anormalmente extensa, o que a torna mais suscetível à agregação. Estes agregados formam inclusões amiloides que se acumulam em várias regiões do cérebro de pacientes com SCA2, denominados corpos de inclusão. No entanto, ainda não está claro se estes agregados são a causa direta da toxicidade observada, uma vez que estudos sugerem que formas menores e solúveis de agregados (oligómeros) podem ser mais tóxicas. Especula-se, inclusive, que a formação de agregados maiores possa representar um mecanismo de defesa celular, ao encapsular oligómeros tóxicos. No entanto, a ataxina-2 mutante pode interagir de maneira anómala com certas proteínas ou perder a capacidade natural de se associar a outras, resultando na sua disfunção. Consequentemente, a ausência de ataxina-2 funcional pode desencadear mecanismos patogénicos que incluem toxicidade mediada por RNA, comprometimento da autofagia, aumento do stress oxidativo, desregulação da homeostase do cálcio e alterações na sinalização celular. A SCA2 geralmente manifesta-se na terceira década de vida, particularmente em indivíduos que contêm mais de 32 repetições CAG no gene ATXN2. Normalmente, o comprimento da expansão de poliglutaminas influencia significativamente a idade em que a doença se manifesta, sendo que expansões maiores são correlacionadas com um aparecimento mais precoce dos sintomas. A SCA2 é clinicamente reconhecida como uma doença multissistémica, com manifestações motoras e não motoras. Esta patologia caracteriza-se pela progressão de uma série de sintomas debilitantes, sendo a ataxia cerebelosa o principal sintoma clínico. Adicionalmente, os pacientes com SCA2 podem apresentar outros sintomas resultantes da degeneração cerebelosa, como disartria, rigidez muscular e disfagia, além de outras manifestações extra-cerebelosas, como movimentos sacádicos oculares lentos, mioclonia e contrações musculares involuntárias. Estes sintomas são o resultado da neurodegeneração que ocorre no córtex, nos gânglios da base, no tronco cerebral, na medula espinal, nos nervos periféricos e, principalmente, no cerebelo, o que faz das células de Purkinje os neurónios mais afetados nesta doença. Embora apenas algumas regiões neuroanatómicas sejam inicialmente comprometidas na SCA2, a neurodegeneração parece propagar-se para outras regiões cerebrais à medida que a doença progride, resultando num agravamento dos sintomas. No entanto, os mecanismos responsáveis pela propagação da doença ainda não estão completamente elucidados. Nos últimos anos, vários estudos têm demonstrado o papel das vesículas extracelulares (EVs, do inglês extracellular vesicles) na propagação de proteínas com conformações aberrantes, associadas a diferentes processos neurodegenerativos. As EVs são estruturas rodeadas por uma bicamada lipídica, secretadas praticamente por todos os tipos celulares e que se diferenciam entre si em termos físicos, moleculares e funcionais. Apesar dessas diferenças, as EVs, de uma forma geral, surgiram como agentes-chave na comunicação intercelular, com capacidade de transportar uma ampla gama de biomoléculas, incluindo ácidos nucleicos, lípidos, metabolitos e proteínas associadas a doenças, que podem influenciar o comportamento das células que as internalizam, seja em contextos fisiológicos ou patológicos. No contexto das doenças de poliglutaminas, investigações recentes apontam para o potencial das EVs como veículos de proteínas mutantes, facilitando a sua distribuição pelo cérebro. Embora o papel das EVs na patogénese da SCA2 ainda esteja numa fase inicial de investigação, evidências sugerem que a transmissão mediada por EVs poderá contribuir significativamente para a progressão da doença, ao promover a disseminação intercelular da ataxina-2 mutante. Para investigar esta hipótese, realizámos um estudo in vivo para avaliar se exossomas, um subtipo de EVs, contendo ataxina-2 mutante facilitam a sua propagação e induzem um fenótipo semelhante ao da SCA2. Para isso, isolámos exossomas de murganhos com fenótipo selvagem (WT, do inglês wild-type) e de murganhos de um modelo de SCA2 e injetámos esses exossomas em murganhos WT recém-nascidos. Três grupos experimentais foram criados, nomeadamente, os WT EVs que foram injetados com exossomas WT, os SCA2 EVs que foram injetados com exossomas provenientes do modelo de SCA2 e, os Sham que foram apenas injetados, sem nenhuma administração, servindo como controlo da injeção. Dado que a SCA2 está associada a sintomas motores, como ataxia, incoordenação, tremores e cãibras musculares, na primeira parte deste estudo foi efetuado um conjunto abrangente de testes comportamentais para avaliar possíveis deficiências motoras. O estudo comportamental começou às 4 semanas de idade e acabou às 16, abrangendo um total de 5 pontos de tempo. De um modo geral, observámos que os murganhos SCA2 EVs exibiram alterações progressivas significativas ao nível da marcha e da postura em vários testes comportamentais, refletindo um fenótipo atáxico em desenvolvimento, provavelmente ligado ao declínio neuromuscular subjacente. No grupo Sham, foram observadas algumas alterações motoras que sugeriram que o próprio procedimento de injeção pode ter influenciado a função motora de forma limitada, realçando a importância da inclusão de controlos Sham para distinguir os efeitos do procedimento dos resultados específicos da doença. Além disso, surgiram diferenças específicas entre os sexos, com os machos a apresentarem uma maior suscetibilidade a deficiências motoras, possivelmente devido a variações nas respostas compensatórias entre os sexos. Na segunda parte deste estudo, os murganhos foram sacrificados às 16 semanas, e efetuamos um conjunto de análises neuropatológicas do cerebelo recorrendo à técnica de imunohistoquímica. Estas análises serviram para avaliar sinais de neuroinflamação (astrogliose), neurodegeneração (perda de células de Purkinje) e para identificar estruturas semelhantes a agregados de ataxina-2 como potenciais indicadores da doença SCA2. Os respetivos resultados demonstraram sinais de astrogliose reativa no grupo dos SCA2 EVs, refletindo processos neuroinflamatórios, enquanto uma resposta astrocítica ligeira no grupo Sham resultou provavelmente do procedimento de injeção. As camadas das células de Purkinje mostraram-se maioritariamente íntegras nos grupos WT EVs e Sham, enquanto as do grupo SCA2 EVs apresentaram algumas interrupções. Na respetiva análise quantitativa do número de células de Purkinje, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, o que possivelmente indica que os SCA2 EVs estavam numa fase inicial de neurodegeneração, ainda não detetável quantitativamente. Na análise dos agregados, o grupo Sham praticamente não apresentou marcação. No entanto, foram observados padrões de marcação distintos nos grupos WT EVs e SCA2 EVs, sugerindo que a ataxina-2 mutante nos SCA2 EVs promove uma formação semelhante a agregados de ataxina-2 em neurónios suscetíveis, enquanto os exossomas dos WT EVs parecem induzir respostas celulares mais generalizadas. De uma forma geral, este estudo sugere que os exossomas contendo a ataxina-2 mutante facilitam a propagação da mesma e induzem um fenótipo semelhante ao da SCA2 in vivo. Estas descobertas reforçam o papel dos exossomas na propagação da doença, destacando o seu potencial como alvo para novas abordagens terapêuticas em doenças neurodegenerativas como a SCA2.
A ataxia espinocerebelosa tipo 2 (SCA2, do inglês spinoceberellar ataxia type 2), descrita pela primeira vez em 1971, é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante, pertencente ao grupo das doenças de poliglutaminas, e é a segunda forma hereditária de ataxia mais prevalente a nível mundial. A SCA2 resulta de uma expansão anormal de trinucleotídeos CAG no gene ATXN2, que codifica a proteína ataxina-2. Esta mutação leva à produção de uma proteína com uma sequência de poliglutaminas anormalmente extensa, o que a torna mais suscetível à agregação. Estes agregados formam inclusões amiloides que se acumulam em várias regiões do cérebro de pacientes com SCA2, denominados corpos de inclusão. No entanto, ainda não está claro se estes agregados são a causa direta da toxicidade observada, uma vez que estudos sugerem que formas menores e solúveis de agregados (oligómeros) podem ser mais tóxicas. Especula-se, inclusive, que a formação de agregados maiores possa representar um mecanismo de defesa celular, ao encapsular oligómeros tóxicos. No entanto, a ataxina-2 mutante pode interagir de maneira anómala com certas proteínas ou perder a capacidade natural de se associar a outras, resultando na sua disfunção. Consequentemente, a ausência de ataxina-2 funcional pode desencadear mecanismos patogénicos que incluem toxicidade mediada por RNA, comprometimento da autofagia, aumento do stress oxidativo, desregulação da homeostase do cálcio e alterações na sinalização celular. A SCA2 geralmente manifesta-se na terceira década de vida, particularmente em indivíduos que contêm mais de 32 repetições CAG no gene ATXN2. Normalmente, o comprimento da expansão de poliglutaminas influencia significativamente a idade em que a doença se manifesta, sendo que expansões maiores são correlacionadas com um aparecimento mais precoce dos sintomas. A SCA2 é clinicamente reconhecida como uma doença multissistémica, com manifestações motoras e não motoras. Esta patologia caracteriza-se pela progressão de uma série de sintomas debilitantes, sendo a ataxia cerebelosa o principal sintoma clínico. Adicionalmente, os pacientes com SCA2 podem apresentar outros sintomas resultantes da degeneração cerebelosa, como disartria, rigidez muscular e disfagia, além de outras manifestações extra-cerebelosas, como movimentos sacádicos oculares lentos, mioclonia e contrações musculares involuntárias. Estes sintomas são o resultado da neurodegeneração que ocorre no córtex, nos gânglios da base, no tronco cerebral, na medula espinal, nos nervos periféricos e, principalmente, no cerebelo, o que faz das células de Purkinje os neurónios mais afetados nesta doença. Embora apenas algumas regiões neuroanatómicas sejam inicialmente comprometidas na SCA2, a neurodegeneração parece propagar-se para outras regiões cerebrais à medida que a doença progride, resultando num agravamento dos sintomas. No entanto, os mecanismos responsáveis pela propagação da doença ainda não estão completamente elucidados. Nos últimos anos, vários estudos têm demonstrado o papel das vesículas extracelulares (EVs, do inglês extracellular vesicles) na propagação de proteínas com conformações aberrantes, associadas a diferentes processos neurodegenerativos. As EVs são estruturas rodeadas por uma bicamada lipídica, secretadas praticamente por todos os tipos celulares e que se diferenciam entre si em termos físicos, moleculares e funcionais. Apesar dessas diferenças, as EVs, de uma forma geral, surgiram como agentes-chave na comunicação intercelular, com capacidade de transportar uma ampla gama de biomoléculas, incluindo ácidos nucleicos, lípidos, metabolitos e proteínas associadas a doenças, que podem influenciar o comportamento das células que as internalizam, seja em contextos fisiológicos ou patológicos. No contexto das doenças de poliglutaminas, investigações recentes apontam para o potencial das EVs como veículos de proteínas mutantes, facilitando a sua distribuição pelo cérebro. Embora o papel das EVs na patogénese da SCA2 ainda esteja numa fase inicial de investigação, evidências sugerem que a transmissão mediada por EVs poderá contribuir significativamente para a progressão da doença, ao promover a disseminação intercelular da ataxina-2 mutante. Para investigar esta hipótese, realizámos um estudo in vivo para avaliar se exossomas, um subtipo de EVs, contendo ataxina-2 mutante facilitam a sua propagação e induzem um fenótipo semelhante ao da SCA2. Para isso, isolámos exossomas de murganhos com fenótipo selvagem (WT, do inglês wild-type) e de murganhos de um modelo de SCA2 e injetámos esses exossomas em murganhos WT recém-nascidos. Três grupos experimentais foram criados, nomeadamente, os WT EVs que foram injetados com exossomas WT, os SCA2 EVs que foram injetados com exossomas provenientes do modelo de SCA2 e, os Sham que foram apenas injetados, sem nenhuma administração, servindo como controlo da injeção. Dado que a SCA2 está associada a sintomas motores, como ataxia, incoordenação, tremores e cãibras musculares, na primeira parte deste estudo foi efetuado um conjunto abrangente de testes comportamentais para avaliar possíveis deficiências motoras. O estudo comportamental começou às 4 semanas de idade e acabou às 16, abrangendo um total de 5 pontos de tempo. De um modo geral, observámos que os murganhos SCA2 EVs exibiram alterações progressivas significativas ao nível da marcha e da postura em vários testes comportamentais, refletindo um fenótipo atáxico em desenvolvimento, provavelmente ligado ao declínio neuromuscular subjacente. No grupo Sham, foram observadas algumas alterações motoras que sugeriram que o próprio procedimento de injeção pode ter influenciado a função motora de forma limitada, realçando a importância da inclusão de controlos Sham para distinguir os efeitos do procedimento dos resultados específicos da doença. Além disso, surgiram diferenças específicas entre os sexos, com os machos a apresentarem uma maior suscetibilidade a deficiências motoras, possivelmente devido a variações nas respostas compensatórias entre os sexos. Na segunda parte deste estudo, os murganhos foram sacrificados às 16 semanas, e efetuamos um conjunto de análises neuropatológicas do cerebelo recorrendo à técnica de imunohistoquímica. Estas análises serviram para avaliar sinais de neuroinflamação (astrogliose), neurodegeneração (perda de células de Purkinje) e para identificar estruturas semelhantes a agregados de ataxina-2 como potenciais indicadores da doença SCA2. Os respetivos resultados demonstraram sinais de astrogliose reativa no grupo dos SCA2 EVs, refletindo processos neuroinflamatórios, enquanto uma resposta astrocítica ligeira no grupo Sham resultou provavelmente do procedimento de injeção. As camadas das células de Purkinje mostraram-se maioritariamente íntegras nos grupos WT EVs e Sham, enquanto as do grupo SCA2 EVs apresentaram algumas interrupções. Na respetiva análise quantitativa do número de células de Purkinje, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos, o que possivelmente indica que os SCA2 EVs estavam numa fase inicial de neurodegeneração, ainda não detetável quantitativamente. Na análise dos agregados, o grupo Sham praticamente não apresentou marcação. No entanto, foram observados padrões de marcação distintos nos grupos WT EVs e SCA2 EVs, sugerindo que a ataxina-2 mutante nos SCA2 EVs promove uma formação semelhante a agregados de ataxina-2 em neurónios suscetíveis, enquanto os exossomas dos WT EVs parecem induzir respostas celulares mais generalizadas. De uma forma geral, este estudo sugere que os exossomas contendo a ataxina-2 mutante facilitam a propagação da mesma e induzem um fenótipo semelhante ao da SCA2 in vivo. Estas descobertas reforçam o papel dos exossomas na propagação da doença, destacando o seu potencial como alvo para novas abordagens terapêuticas em doenças neurodegenerativas como a SCA2.
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Ataxia espinocerebelosa do tipo 2 (sca2) Ataxina-2 Vesículas extracelulares Propagação da doença Exossomas