Genetic analysis of SURF gene in patients with isolated complex IV deficiency

Viegas, Ana Teresa de Barros

http://hdl.handle.net/10400.1/10880

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Tese de Mestrado - Ana Viegas _versao 2_.pdf		660.72 KB	Adobe PDF	Download

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Authors

Viegas, Ana Teresa de Barros

Advisor(s)

Grazina, Manuela

Abstract(s)

A mitocôndria é um organelo subcelular com um papel preponderante no metabolismo energético, em particular, relacionado com a fosforilação oxidativa (OXPHOS). Encontra-se presente em maior número em tecidos e órgãos que requerem elevados níveis de energia, como por exemplo, cérebro e músculo. A produção de ATP (energia) ocorre pelo processo de OXPHOS, num sistema multienzimático, constituído por cinco complexos proteicos e dois transportadores intermediários de electrões que formam o sistema da cadeia respiratória mitocondrial. As doenças mitocondriais são caracterizadas por defeitos na OXPHOS, constituindo um grupo designado por Doenças da Cadeia Respiratória Mitocondrial (MRCD). Diversos estudos têm comprovado que o sistema de OXPHOS é codificado pelo genoma mitocondrial (mtDNA) e nuclear (nDNA), o que leva a que a função mitocondrial esteja dependente da coordenação e interacção entre os dois genomas. Assim, mutações em qualquer um dos genomas podem originar uma disfunção mitocondrial. Consequentemente, as DCRM são caracterizadas por uma enorme variedade de sintomas e encontram-se associadas a todos os tipos de hereditariedade, podendo-se manifestar em qualquer idade, desde a infância até à idade adulta, o que torna o seu diagnóstico complexo. Qualquer alteração num dos cinco complexos pode afectar o funcionamento do sistema de OXPHOS. Contudo, os défices dos complexos enzimáticos I e IV são os mais frequentemente observados. A citocromo c oxidase (COX) – complexo IV - é o componente terminal da cadeia de transporte de electrões, que são transferidos do citocromo c para o oxigénio molecular, reduzindo-o a água. Este complexo é constituído por três subunidades codificadas pelo genoma mitocondrial (COX I, COX II e COX III) e dez subunidades codificadas pelo genoma nuclear (COX4, COX5A, COX5B, COX6A, COX6B, COX6C, COX7A, COX7B, COX7C e COX8). Alguns estudos têm referido que estas subunidades conferem estabilidade estrutural e modulam a actividade da enzima, estando envolvidas na produção de energia em diferentes tecidos, bem como no desenvolvimento ontogenético. A biogénese e o assembly do complexo IV mitocondrial ocorrem de acordo com uma sequência temporizada de diversos passos de incorporação das treze subunidades. Este processo resulta na formação de intermediários (S1-S4) e depende de um elevado número de genes específicos, tanto no genoma nuclear como no genoma mitocondrial. Alterações nesses genes podem levar a falhas na actividade daquele complexo. A síndrome de Leigh (LS) é a doença neurodegenerativa mitocondrial progressiva, podendo ocorrer na infância ou na idade adulta e é caracterizada pela presença de lesões neurológicas específicas. Esta doença tem sido relacionada com o défice da actividade da COX em dois grupos de doentes diferentes: LS típico, associado ao défice isolado grave; e LS atípico, com défice parcial da COX. Os doentes do primeiro grupo têm sido frequentemente diagnosticados com mutações no gene SURF1, correspondendo a 10-15% dos casos. O gene Surfeit-1 (ou SURF1) é um gene nuclear que contém 4.696bp e encontrase localizado na posição do cromossoma 9q34.2. Este codifica um polipeptídeo hidrofóbico (Surfeit locus protein 1 – Surf1p), que se encontra na membrana interna mitocondrial e que está envolvido no assembly da COX. Este gene pertence a um cluster de genes housekeeping, cuja extremidade 5’ é extremamente rica em GC. Diversos estudos mostraram que a Surf1p está envolvida no assembly da COX, ao nível dos intermediários S2 e S3, relativamente à inserção da subunidade COX II no subcomplexo COX I + COX 4 + COX5A. Assim, o défice isolado da COX, devido à ausência/disfunção da Surf1p, está associado a uma falha no assembly do complexo, mais especificamente, antes da inserção das subunidades II e III no subcomplexo anteriormente formado, o que leva a uma diminuição da incorporação das subunidades da COX e, consequentemente, menor quantidade da holoenzima COX. Esta redução foi demonstrada, por vários autores, em doentes com LS portadores de mutações no SURF1, apoiando esta hipótese. Actualmente, existem mais de 40 mutações descritas neste gene nuclear. O presente trabalho tem como objectivo identificar alterações no gene SURF1 em doentes com défice isolado da COX. Com este propósito, a análise genética foi realizada através das técnicas de sequenciação automática e RFLP, tendo sido também utilizadas ferramentas de análise in silico para previsão da patogenicidade das alterações identificadas. Para este trabalho, foram usadas amostras de DNA, previamente extraídas no Laboratório de Bioquímica Genética, a partir de tecido proveniente de 24 doentes com défice isolado da COX (<40% que o normal), identificado por espectofotometria. A análise genética do gene SURF1 (exões 3 – 9) na amostragem estudada, permitiu identificar oito alterações diferentes, das quais quatro ainda não se encontram descritas, em 24 doentes. Das oito variações de sequência, todas ocorrem em zonas conservadas ao longo da evolução, e quatro ocorrem em zonas não codificantes, enquanto que as restantes surgem em exões; contudo, apenas duas alteram o aminoácido (missense). A análise in silico das variações de sequência sugere que é pouco provável que as alterações nos intrões afectem o processo de splicing; no entanto, as duas variações missense (c.574C>T e c.883C>T) são provavelmente patogénicas. A alteração c.574C>T, no exão 6, leva à substituição de arginina por triptofano e foi identificada em homozigotia no doente 6, com LS, o que está de acordo com estudos anteriormente realizados, que associam a presença desta alteração à doença. A alteração c.883C>T, no exão 9, foi identificada em heterozigotia no doente 16 e origina a substituição de arginina por cisteína num doente com menos de cinco anos de idade, que apresenta síndrome malformativo, atraso do desenvolvimento psicomotor e fácies grosseira. Esta variação de sequência ainda não se encontra descrita e poderá ser importante na identificação das causas do fenótipo clínico. Como perspectiva futura e no sentido de complementar este estudo, pretende-se analisar os exões 1 e 2 do gene, de modo a verificar a existência de mutações responsáveis pela doença e realizar estudos funcionais que comprovem a associação das alterações identificadas com o fenótipo clínico. Seria ainda útil analisar controlos normais para esclarecer melhor a existência das alterações apenas em doentes. Este trabalho representa uma contribuição positiva para o diagnóstico genético dos doentes com défice isolado da COX no laboratório de acolhimento, com um impacto importante no aconselhamento genético.