Growth conditions, omega - 3 fatty acid concentrations and gene expression of fatty acid desaturases in Portulaca oleracea leaves

Teixeira, Monica

http://hdl.handle.net/10400.1/2119

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doctoral thesis 2010.pdf		3.28 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Teixeira, Monica

Advisor(s)

Carvalho, Isabel Saraiva de

Bordelius, Maria da Conceição

Abstract(s)

A beldroega (Portulaca oleracea), foi seleccionada como sistema de estudo para este trabalho com base no seu elevado valor nutricional, em particular no conteúdo en ácidos gordos polinsaturados, e a tolerância demonstrada à seca e salinidade. O trabalho de investigação aqui desenvolvido pode ser dividido em quatro pontos essenciais: (i) o estudo dos efeitos da salinidade no valor nutricional da beldroega; (ii) isolamento e caracterização dos genes de desaturases envolvidos na síntese de ácidos gordos polinsaturados; (iii) estudo do efeito de factores ambientais, como temperatura, salinidade e corte, nos níveis de expressão dos genes de desaturases e na accumulação de ácidos gordos polinsaturados; (iv) estabelecimento de linhas de cultura de células de P. oleracea para a produção in vitro de ácidos gordos polinsaturados e outras substâncias biologicamente activas. Na primeira parte do trabalho avaliámos o efeitos de quatro regimes salinos (0, 60, 120 e 240 mM NaCl) na composição química da fracção aérea da beldroega. A salinidade afectou o desenvolvimento e o rendimento das culturas de beldroega, apesar de uma redução significativa da fracção aérea da beldroega ser apenas visível no regime salino mais elevado. A composição nutritional da beldroega foi negativamente afectada pela exposição aos tratamentos, com uma redução do potencial nutricional da cultura. Porém, a composição nutricional da cultura exposta a 60 mM NaCl foi similar à cultura control com um teor em lípidos totais mais elevado. As culturas de beldroega possuiam um elevado teor em minerais, com quantidades particularmente elevadas de magnésio e potássio. Quando expostas a regimes salinos elevados, os niveis de potássio e cálcio diminuiram e os niveis de sódio e magnésio aumentaram. Este desiquilíbrio iónico deu origem a elevados índices de Na/K, Mg/K, Na/Ca e Mg/Ca, o que resultou na redução de rendimento nas culturas expostas ao regime salino mais severo. De acordo com estes resultados podemos afirmar que a beldroega é uma excelente candidata à cultura em áreas de salinidade moderada (≤ 60 mM) em que a introsão de água salgada ou a qualidade de água de irrigação constituem um problema para o estabelecimento de outras culturas mais sensíveis. Uma vez que uma das características nutricinais mais relevante da beldroega é o seu elevado conteúdo em àcidos gordos polinsaturados, a segunda parte deste trabalho incidiu no estudo da biosíntese de ácidos gordos polinsaturados, particularmente no isolamento e caracterização dos genes que codificam para desaturases. Foram isolados três genes completos de omega-6 dessaturases, aqui designados por PoleFAD2-1, PoleFAD2-2 and PoleFAD6, e dois genes completos de omega-3 desaturases, aqui designados por PoleFAD7 e PoleFAD8. Um clone parcial de uma potencial omega-3 desaturase microssomal, aqui designado por PoleFAD3-A foi também isolado. A sequência polipeptídica dos genes isolados apresentou elevada homologia com sequências já publicadas de outras espécies vegetais (GeneBank ). Uma análise mais promenorizada das sequências polipeptídicas revelou a presenca de oito histidinas agrupadas em três motivos conservados na família das desaturases, essenciais para o estabelecimento do centro catalítico da enzima. A presença de um péptido sinal na extremidade azotada da cadeia, envolvido no transporte para o plastídio, nos clones PoleFAD6, PoleFAD7 e PoleFAD8, indica uma elevada probabilidade destas enzimas estarem localizadas nas membranas dos cloroplastros. Nas duas isoformas do gene FAD2 foi identificada uma sequência rica em amino-ácidos aromáticos (- YGNKS/ -YNNTL) na extremidade carbonada da cadeia polipeptídica, que tem sido referenciada como péptido sinal no transporte para o retículo endoplasmático. A previsão de três a quarto domínios transmembranares nas sequências polipéptidas sugere que estas desaturases são transmembranares. Neste trabalho também foi incluída a expressão de dois dos genes plastidiais isolados, PoleFAD6 e PoleFAD7 em Saccharomyces cerevisiae, para a caracterização funcional das desaturases. Infelizmente, não fomos capazes de concluir este estudo com sucesso, uma vez que não foi detectada qualquer actividade dos clones nas condições testadas. Porém foi possível verificar, através de ensaios de fluorescência, que ambas as enzimas foram sintetizadas e accumuladas no organello alvo da célula: as membranas celulares. Temperatura, pH e suplementação do meio com ferro aparentemente não afectaram os níveis de expressão das enzymas, apesar de se ter detectado uma fraca actividade da omega-6 desaturase (PoleFAD6) a baixos valores de pH (4-5), identificada pela presença do produto de desaturação, ácido linoleico, no cromatograma (GC). Aparentemente, as enzimas estão a ser sintetizadas pela levedura e são acumuladas no organelo alvo, mas não numa forma funcional. È possivel que erros de tradução ou na formação do centro catalítico estejam na origem da producão de uma forma não activa da enzima. Estudos anteriores demonstraram que factores ambientais, como a salinidade, afectam o teor em ácidos gordos polinsaturados nas culturas de beldroega, pelo que decidimos verificar o efeito da salinidade, corte e temperaturas baixas nos níveis de expressão dos genes das desaturases nesta cultura. Diferenças nos padrões de expressão destes genes foram detectadas para os diferentes stresses impostos, o que sugere que estes genes possam ter diferentes mecanismos de regulação a nível transcriptional ou pós-transcripcional. A exposição das culturas a temperaturas baixas (5 ºC) afectou os níveis de transcrição dos genes microsomais, PoleFAD2-2 e PoleFAD3, mas não afectou de uma forma significativa os genes cloroplastidiais, com excepção do PoleFAD8, em que um aumento significativo na expressão foi detectado em resposta às baixas temperaturas. Um acréscimo paralelo nos níveis de ácido linoleico(LA) e ácido linolénico(ALA) também foi detectado nas culturas expostas às baixas temperaturas. A aplicação de dois cortes longitudinais em folhas de beldroega originou um acréscimo dos níveis de expressão dos genes plastidiais, PoleFAd6, PoleFAD7 e PoleFAD8, acompanhado de um aumento da accumulação dos respectivos produtos de desaturação LA e ALA. De um modo geral, a exposição das culturas a diferentes regimes salinos, induziu um decréscimo nos níveis de transcrição das desaturases, com excepção do gene FAD8, que apresentou um aumento significativo nos níveis de expressão com a exposição das culturas a um nível de salinidade moderado (60 mM NaCl). Aparentemente factores ambientais tais como baixas temperaturas e salinidade têm um papel nos mecanismos de regulação da transcrição do gene FAD8, ilustrado neste estudo pelo acréscimo significativo dos níveis de expressão em todos os tratamentos aplicados. A última parte deste trabalho consistiu no desenvolvimento de linhas de cultura de células a partir de explantes de P. oleracea, para a produção in vitro de ácidos gordos polinsaturados e/ou outros compostos biologicamente activos. O processo completo de produção de calli a partir da semente levou cerca de 6 -8 semanas. Três estruturas principais foram obtidas a partir de explantes de beldroega cultivados em meio sólido com diferentes proporções de fitohormonas (NAA/BAP): calli friáveis brancos (não fotossintéticos) / verdes (fotosintéticos) (WFC/ GFC), calli compacto verde com forma semelhante a um embrião (GCEC) e eflorescências de folhas vermelhas (RLE). Uma vez que algumas desaturases estam localizadas nas membranas dos cloroplastros, decidimos utilizar os calli fotosintéticos para estes estudos. Em cultura líquida, os calli friáveis originam uma estrutura circular parcialmente differenciada que pode ser utilizada para a produção in vitro de PUFAs. Quantidades mínimas de 3 mg LA/g tecido fresco e de 1 mg ALA/g fresco foram produzidas pelo sistema actual. Devido ao elevado índice de crescimento, com elevada produção de biomassa e o conteúdo em PUFAs, estas estruturas estão a ser avaliadas como potenciais fontes vegetais de PUFAs. Os resultados deste estudo originaram uma patente que está neste momento sob avaliação. Existe algum interesse na comercialização deste produto como suplemento nutricional para peixes e gado, com o objectivo de aumentar o conteúdo em ácidos gordos polinsaturados no músculo e produtos derivados animais.