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From pluripotency to early events leading to cardiogenesis
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Abstract(s)
Heart diseases are the leading cause of death worldwide, which includes acquired cardiovascular diseases and congenital heart diseases. The Cited2 gene is important for proper heart development and cardiac cell differentiation from pluripotent stem cells. Previous studies suggested that the role of Cited2 in cardiac differentiation could begin during the early events that occur in pluripotent cells that undergo differentiation. In mouse embryonic stem cells, Cited2 is important for self-renewal maintenance, as cells die or differentiate under Cited2-depleted conditions. In differentiation, embryonic stem cells depleted of Cited2 at the onset of differentiation show an impairment of cardiac cell differentiation. However, the mechanisms behind these observed phenotypes of Cited2-depletion are not well established. In this work, differentially expressed genes were identified in undifferentiated mouse embryonic stem cells and differentiated cells on day-4 of differentiation. Thus, using mouse embryonic stem cells that can be conditionally depleted of Cited2, after 16 hours of incubation it was observed that Cited2-depleted cells under undifferentiation conditions tend to show increased levels of the DNA damage marker γH2AX, concomitant with decreased expression of DNA repair genes (Rad51c, Rad9b, and Mdc1) and increased expression of pro-apoptotic genes (p21, Ptges, Plk2). In differentiation conditions using the hanging drop method, on day-4 of differentiation, epigenetic mark H3K27ac showed a decrease in the promoter region of cardiopoietic genes concordant with their downregulation (Brachyury, Cdx2, Dkk1, Isl1, Kdr, Mesp1, Wnt5a). However, the results of the H3K27me3 marks, showed higher variability and did not match the reciprocal marks of H3K27ac. Moreover, the increase in H3K27ac mark in undifferentiated Cited2-depleted cells corresponded, as expected, to an upregulation of the same genes. Lastly, histone acetyltransferase activity assay using the whole cell extract showed a tendency to increase acetylation in Cited2-depleted cells. In conclusion, the role of Cited2 in DNA repair and the cause of increased cell death remains to be established, while delayed expression of mesoderm/cardiac genes could be associated with misregulation of epigenetic H3K27(me3/ac) marks at the promoters of cardiopoietic genes.
As doenças cardíacas são responsáveis pela maioria das mortes a nível mundial de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Este grupo de doenças inclui as doenças congénitas cardíacas e as doenças cardiovasculares. Embora as doenças cardiovasculares possam ser mitigadas pela adoção de estilos de vida saudáveis, as doenças congénitas cardíacas não podem ser tão facilmente evitadas. Isto, porque estas doenças têm uma componente genética que leva à malformação do coração, e apesar de em alguns casos ser possível operar os recém-nascidos, ainda não há terapias génicas que resolvam a totalidade destes casos. Portanto, é assim necessário perceber melhor o desenvolvimento cardíaco e o papel que alguns genes têm neste complexo processo. Esta complexidade reflete-se na coordenação de expressão de diferentes fatores de transcrição (e.g. Brachyury, Nkx2.5, Mesp1, Isl1), e ativação de diferentes vias de sinalização (e.g. FGF, TGF, BMP, NODAL, e a WNT). Estas vias atuam em sincronia tendo um efeito de ativação ou inibição de fatores de transcrição dependendo do tecido do embrião e do estádio de desenvolvimento (ou seja, também depende do tempo decorrido). Este trabalho foca-se na compreensão dos diferentes papeis do gene Cited2 em condições de pluripotência e de diferenciação. Foi demonstrado que mutações neste gene em humanos estão associadas a doenças congénitas cardíacas. Em laboratório, a deleção deste gene em ratinho (Mus musculus) leva à sua morte in utero, principalmente por malformações do coração. Estudos em células estaminais embrionárias de ratinho mostraram que Cited2 é também importante para a manutenção da pluripotência uma vez que Cited2 promove a expressão de Nanog, que por sua vez leva à expressão de outros genes importantes para a manutenção da pluripotência. Contudo, quando Cited2 é depletado (ou seja, a expressão é diminuída), verifica-se um aumento da morte celular e da diferenciação espontânea; mesmo em células mantidas em condições de pluripotência, usando meio suplementado com LIF. Em contexto de diferenciação verificou-se, usando também células estaminais de ratinho, que a depleção de Cited2 no início do protocolo da gota suspensa levou a uma diminuição na capacidade de diferenciação cardíaca. Trabalhos anteriores do laboratório mostraram que existe um atraso na expressão de genes importantes para a especificação da mesoderme e de diferenciação cardíaca, nomeadamente: Brachyury, Mixl1 e Mesp1. Este trabalho partiu da análise de dados de “microarrays” (Affymetrix) de um trabalho anterior no laboratório, que tinha como alvo identificar os genes diferencialmente expressos entre dois grupos de células: as células controlo (com expressão de Cited2) vs as células tratadas (sem expressão de Cited2); e em duas condições experimentais: pluripotência e diferenciação. Deste modo, o trabalho foi separado em duas partes, uma dedicada ao papel do Cited2 em pluripotência e outra em diferenciação. Para compreender o papel de Cited2 na pluripotência, foram feitas experiências com células de ratinho que permitem a depleção condicional de Cited2 quando se adiciona o composto 4HT ao meio de cultura (usando como controlo etanol). Assim, após análise dos “microarrays” verificou-se que existiam alguns genes de reparação do ADN que estavam regulados negativamente (Rad51c, Rad9b e Mdc1), enquanto alguns genes que promovem a morte celular por apoptose estavam regulados positivamente (p21, Ptges, Plk2). Portanto, estes resultados sugeriram que um possível mecanismo que leva ao aumento de morte celular quando Cited2 é depletado que pode estar associado com dano do ADN. Deste modo, a quantidade de dano nas células foi avaliada por “Western Blot” e por microscopia de confocal, onde foi usado como marcador de dano no ADN a histona H2AX. Na presença de dano no ADN esta histona é fosforilada, e passa a denominar-se por γH2AX. Assim, verificou-se que apesar de existir um aumento dos níveis de γH2AX depois de 16 horas de tratamento, os resultados não foram estatisticamente significativos. Portanto, não foi possível estabelecer com certeza que a causa de morte celular devido à depleção de Cited2 é causada pelo aumento de dano no ADN. Contudo, os resultados de “microarray” sugerem que genes associados ao p53 possam estar envolvidos (referidos acima). Como perspetivas futuras é proposto que se estude a possível modelação por CITED2 da atividade do p53 através da acetilação por p300/CBP. Relativamente ao papel de Cited2 na diferenciação, a análise dos “microarrays” sugeriu que alguns genes que estavam regulados negativamente são controlados por um complexo repressor de expressão (PRC2). Portanto levantou-se a hipótese de que o atraso na expressão dos genes marcadores da mesoderme e de diferenciação cardíaca possam estar bloqueados quando Cited2 está pouco expresso. Deste modo, realizaram-se experiências de immunoprecipitação de cromatina tendo como alvo duas modificações pós-traducionais: H3K27me3 e H3K27ac. Estas modificações são recíprocas, onde a tri-metilação (me3) está associada a repressão dos genes, e a acetilação (ac) está associada a ativação de expressão dos genes. Os resultados mostraram que, de facto, embora não estatisticamente significativos, existe uma tendência para uma diminuição da marcação H3K27ac ao dia-4 de diferenciação nos promotores dos genes Brachyury, Cdx2, Dkk1, Isl1, Kdr, Mesp1 e Wtn5a. Concordante com estes resultados, e como seria de esperar, estes genes encontraram-se negativamente regulados. O inverso foi observado para as condições de pluripotência, ou seja, a baixa expressão de Cited2 levou a uma tendência para aumento de acetilação, que foi seguida pelo também esperado aumento de expressão desses mesmos genes. Contudo, a marcação de metilação mostrou ter um erro maior, e não seguia a esperada reciprocidade com os resultados da acetilação. Por fim, de modo a perceber a influência de Cited2 na capacidade de acetilação das células foi realizado um ensaio in vitro para comparar os níveis de acetilação de extratos proteicos totais de células expressando e não-expressando Cited2. Os resultados mostram que as células depletadas de Cited2 têm um aumento de acetilação. Contudo, não foi possível demonstrar que a acetilação de histonas por p300/CBP é diretamente modulado por CITED2. Em suma, este trabalho não permitiu de forma clara demonstrar que o aumento da morte e diferenciação espontânea seja causado por dano no DNA aquando da depleção de Cited2. No entanto, este trabalho propõe que o atraso da expressão de genes importantes para a diferenciação cardíaca tenha uma componente associada à desregulação de mecanismos epigenéticos, nomeadamente regulação de H3K27me3/ac.
As doenças cardíacas são responsáveis pela maioria das mortes a nível mundial de acordo com a Organização Mundial de Saúde. Este grupo de doenças inclui as doenças congénitas cardíacas e as doenças cardiovasculares. Embora as doenças cardiovasculares possam ser mitigadas pela adoção de estilos de vida saudáveis, as doenças congénitas cardíacas não podem ser tão facilmente evitadas. Isto, porque estas doenças têm uma componente genética que leva à malformação do coração, e apesar de em alguns casos ser possível operar os recém-nascidos, ainda não há terapias génicas que resolvam a totalidade destes casos. Portanto, é assim necessário perceber melhor o desenvolvimento cardíaco e o papel que alguns genes têm neste complexo processo. Esta complexidade reflete-se na coordenação de expressão de diferentes fatores de transcrição (e.g. Brachyury, Nkx2.5, Mesp1, Isl1), e ativação de diferentes vias de sinalização (e.g. FGF, TGF, BMP, NODAL, e a WNT). Estas vias atuam em sincronia tendo um efeito de ativação ou inibição de fatores de transcrição dependendo do tecido do embrião e do estádio de desenvolvimento (ou seja, também depende do tempo decorrido). Este trabalho foca-se na compreensão dos diferentes papeis do gene Cited2 em condições de pluripotência e de diferenciação. Foi demonstrado que mutações neste gene em humanos estão associadas a doenças congénitas cardíacas. Em laboratório, a deleção deste gene em ratinho (Mus musculus) leva à sua morte in utero, principalmente por malformações do coração. Estudos em células estaminais embrionárias de ratinho mostraram que Cited2 é também importante para a manutenção da pluripotência uma vez que Cited2 promove a expressão de Nanog, que por sua vez leva à expressão de outros genes importantes para a manutenção da pluripotência. Contudo, quando Cited2 é depletado (ou seja, a expressão é diminuída), verifica-se um aumento da morte celular e da diferenciação espontânea; mesmo em células mantidas em condições de pluripotência, usando meio suplementado com LIF. Em contexto de diferenciação verificou-se, usando também células estaminais de ratinho, que a depleção de Cited2 no início do protocolo da gota suspensa levou a uma diminuição na capacidade de diferenciação cardíaca. Trabalhos anteriores do laboratório mostraram que existe um atraso na expressão de genes importantes para a especificação da mesoderme e de diferenciação cardíaca, nomeadamente: Brachyury, Mixl1 e Mesp1. Este trabalho partiu da análise de dados de “microarrays” (Affymetrix) de um trabalho anterior no laboratório, que tinha como alvo identificar os genes diferencialmente expressos entre dois grupos de células: as células controlo (com expressão de Cited2) vs as células tratadas (sem expressão de Cited2); e em duas condições experimentais: pluripotência e diferenciação. Deste modo, o trabalho foi separado em duas partes, uma dedicada ao papel do Cited2 em pluripotência e outra em diferenciação. Para compreender o papel de Cited2 na pluripotência, foram feitas experiências com células de ratinho que permitem a depleção condicional de Cited2 quando se adiciona o composto 4HT ao meio de cultura (usando como controlo etanol). Assim, após análise dos “microarrays” verificou-se que existiam alguns genes de reparação do ADN que estavam regulados negativamente (Rad51c, Rad9b e Mdc1), enquanto alguns genes que promovem a morte celular por apoptose estavam regulados positivamente (p21, Ptges, Plk2). Portanto, estes resultados sugeriram que um possível mecanismo que leva ao aumento de morte celular quando Cited2 é depletado que pode estar associado com dano do ADN. Deste modo, a quantidade de dano nas células foi avaliada por “Western Blot” e por microscopia de confocal, onde foi usado como marcador de dano no ADN a histona H2AX. Na presença de dano no ADN esta histona é fosforilada, e passa a denominar-se por γH2AX. Assim, verificou-se que apesar de existir um aumento dos níveis de γH2AX depois de 16 horas de tratamento, os resultados não foram estatisticamente significativos. Portanto, não foi possível estabelecer com certeza que a causa de morte celular devido à depleção de Cited2 é causada pelo aumento de dano no ADN. Contudo, os resultados de “microarray” sugerem que genes associados ao p53 possam estar envolvidos (referidos acima). Como perspetivas futuras é proposto que se estude a possível modelação por CITED2 da atividade do p53 através da acetilação por p300/CBP. Relativamente ao papel de Cited2 na diferenciação, a análise dos “microarrays” sugeriu que alguns genes que estavam regulados negativamente são controlados por um complexo repressor de expressão (PRC2). Portanto levantou-se a hipótese de que o atraso na expressão dos genes marcadores da mesoderme e de diferenciação cardíaca possam estar bloqueados quando Cited2 está pouco expresso. Deste modo, realizaram-se experiências de immunoprecipitação de cromatina tendo como alvo duas modificações pós-traducionais: H3K27me3 e H3K27ac. Estas modificações são recíprocas, onde a tri-metilação (me3) está associada a repressão dos genes, e a acetilação (ac) está associada a ativação de expressão dos genes. Os resultados mostraram que, de facto, embora não estatisticamente significativos, existe uma tendência para uma diminuição da marcação H3K27ac ao dia-4 de diferenciação nos promotores dos genes Brachyury, Cdx2, Dkk1, Isl1, Kdr, Mesp1 e Wtn5a. Concordante com estes resultados, e como seria de esperar, estes genes encontraram-se negativamente regulados. O inverso foi observado para as condições de pluripotência, ou seja, a baixa expressão de Cited2 levou a uma tendência para aumento de acetilação, que foi seguida pelo também esperado aumento de expressão desses mesmos genes. Contudo, a marcação de metilação mostrou ter um erro maior, e não seguia a esperada reciprocidade com os resultados da acetilação. Por fim, de modo a perceber a influência de Cited2 na capacidade de acetilação das células foi realizado um ensaio in vitro para comparar os níveis de acetilação de extratos proteicos totais de células expressando e não-expressando Cited2. Os resultados mostram que as células depletadas de Cited2 têm um aumento de acetilação. Contudo, não foi possível demonstrar que a acetilação de histonas por p300/CBP é diretamente modulado por CITED2. Em suma, este trabalho não permitiu de forma clara demonstrar que o aumento da morte e diferenciação espontânea seja causado por dano no DNA aquando da depleção de Cited2. No entanto, este trabalho propõe que o atraso da expressão de genes importantes para a diferenciação cardíaca tenha uma componente associada à desregulação de mecanismos epigenéticos, nomeadamente regulação de H3K27me3/ac.
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Keywords
Cited2 DNA Differentiation Pluripotency H3K27me3/ac Mouse