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The molecular mechanisms underlying erroneous segregation on Warsaw Breakage Syndrome
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Abstract(s)
Given the vast number of mechanisms where cohesin is involved, problems that affect the structure of cohesin or its cofactors can lead to a variety of pathologies, namely cancer and some rare syndromes. The term cohesinopathies is used to describe rare syndromes that share mutations in the cohesin complex or at its regulators. Warsaw Breakage Syndrome (WABS) belongs to the group of cohesinopathies due to overlapping clinical features and to be caused by a bi-allelic mutation in the protein DDX11, known to regulate cohesin. In addition, DDX11 functions as a DNA helicase during replication. The etiology of this disease is still unknown, but two no-mutual exclusive hypotheses have been proposed: the first is that it can be caused by problems in DNA replication and reparation, and the second is that it can be caused by problems during mitosis. In this project, we aim to try to better understand the mechanisms that underline WABS etiology using WABS patient cell lines and RPE-1 CRISPR DDX11 KO cell lines in combination with imaging techniques. For that, we capitalized in ongoing research in the lab to evaluate three possible outcomes of how mis-regulate mitosis contributes to WABS etiology. We evaluated the localization of the DDX11 during mitosis, but unspecific binding of the antibody made it impossible for us to draw conclusions about the DDX11 importance during this cell cycle stage. Then we studied the localization of the Aurora B kinase, an important protein involved in the metaphase checkpoint. Despite previous publications suggesting that DDX11 impacts Aurora B, in our system the impact on Aurora B was more subtle. Finally, we studied the localization of Topoisomerase II a, a protein responsible for resolve the DNA catenation. This isomerase has a later localization across the chromosomes upon DDX11 perturbations. Topoisomerase typical more centromeric localization changed to an almost even distribution along all the chromosomes in WABS models. From this work execution, we identified at least one very promising candidate to explore, yet more experiments are necessary in the future to strengthen results and final conclusions about the mechanisms underlining this disease.
O ciclo celular é uma sequência de processos, pelos quais uma célula é capaz de crescer e se dividir em duas copias idênticas. Este processo pode ser dividido em duas grandes fases, a interfase, que é composta pela fase G1, S e G2 e a mitose, esta composta por seis estádios, a prófase, prometáfase, metáfase, anáfase, telófase e citocinese. De um modo simplista, pode-se dizer que a interfase é onde as células passa a maior parte da sua vida, crescem e duplicam o seu genoma para depois entrarem em mitose onde efetivamente a células divide o seu genoma duplicado nas duas células filhas de um modo equitativo. A passagem e cada fase do ciclo celular é altamente regulado para garantir que nenhum erro ocorra em nenhum dos processos, e que culmine com a formação de células com números anormais de cromossomas, isto é aneuploidia. A presença de um conteúdo genético anormal (quem em número ou organização) levam a que estas células tenham funções alteradas que na maioria são alterações nocivas para o organismo. Por isso, não é surpreendente que aneuploidia esteja tão frequentemente associadas a patologias como o cancro e doenças do desenvolvimento. A aneuploidia pode surgir por alterações ao nível ou durante a replicação do ADN ou por exemplo devido a agente exógenos mutagénicos. Durante a mitose, problemas ao nível na maquinaria do fuso mitótico, cinetócoros, centrossomas ou em estruturas cromossómicas podem levar a células aneuploides. Assim de modo impedir que estes erros ocorram há diversos mecanismos para proteger a célula, os chamados “checkpoints”, os quais estão distribuídos ao longo do ciclo. Estes têm o grande objetivo de garantir a integridade genómica das células, só deixando a célula progredir pelo ciclo se cumprir todos os requerimentos associados. Desde a replicação do ADN até a sua separação nas células filhas formadas, é necessário assegurar que cromatídeos irmãos se mantenham juntos. A coesina é um complexo proteico composto por 3 subunidades, a SMC1, a SMC3 e a Rad21, que forma um anel proteico que tem a capacidade de aprisionar ambas as cadeias de ADN irmãs, desta forma prevenindo que haja uma separação prematura dos dois cromatídeos irmãos. Nos últimos anos foi descoberto que a coesina é capaz de desempenhar funções em outras fases do ciclo celular, nomeadamente na regulação da expressão génica, na organização e integridade do genoma. Diversas patologias, como cancro ou síndromes raras têm associadas alterações nas subunidades da coesina ou nos seus reguladores. Aliás as coesinopatias é conjunto de síndromes raras que todas têm em comum o facto de todas serem originadas por problemas na coesina, ou nos seus cofatores e reguladores. Neste projeto procurou-se aprofundar o conhecimento dos mecanismos biológicos que levam ao desenvolvimento de uma coesinopatia chamada de Síndrome de rutura de Varsóvia (do inglês Warsaw Breakage Syndrome, tipicamente denominada por WABS). WABS é uma síndrome rara identificada pela primeira vez em 2010, sendo que até hoje apenas 23 casos foram reportados. Esta é causada por uma mutação bialélicas no gene que codifica a proteína DDX11, que é uma helicase de ADN e um cofator do loading coesina, embora se desconheça os mecanismos exatos. A etiologia desta doença ainda é desconhecida, mas duas hipóteses não mutuamente exclusivas são propostas: a primeira pressupõe problemas durante a replicação ou nos mecanismos de reparação do ADN são responsáveis pelo desenvolvimento da WABS. A segunda, sugere que problemas ao nível da segregação cromossómica duranta a mitose causa o desenvolvimento desta. Neste trabalho recorreu-se a linhas humanas para investigação a segunda hipótese, em particular células de fibroblastos obtida de dois indivíduos diagnosticados com WABS (e respetiva linha célula de controlo obtida de um individuo saudável), assim como a células RPE-1 modificadas geneticamente utilizando a técnica CRISPR no qual o gene DDX11 foi knockout. Assim, utilizando estas ferramentas testamos: (i) localização do DDX11 nas células WABS durante a mitose. Porém, devido a problemas de inespecificidade do anticorpo foi nos impossível retirar quaisquer conclusões sobre a localização e inferir sob a importância do DDX11 durante a mitose. (ii) Perceber a localização e distribuição, em cromossomas mitóticos, da cináse Aurora B, uma proteína necessária à correção e aferição da ligação entre os cromatídeos irmão e os microtúbulos do fuso mitótico prevenindo erros na segregação cromossómica. Num estudo prévio observou-se em células de galinha (DT40) que o knockout (KO) de DDX11 causa uma deslocalização desta proteína ao nível centromérico. Neste trabalho realizado, ao contrário do estudo prévio, observou-se um aumento da distribuição de Aurora B ao nível da região peri- e centromérica. Por fim, (iii) estudou-se a distribuição da enzima Topoisomerase II, uma responsável por resolver os emaranhamentos do ADN, que ocorrem de forma natural durante o processo de replicação do ADN. Sabe-se que a não expressão de DDX11 leva a baixos níveis da proteína coesina o que em certos contextos pode levar a uma separação precoce dos cromatídeos irmãos. Em células de indivíduos com WABS os nossos estudos laboratoriais mostraram que não era o caso, pelo que se colocou a hipótese que problemas ao nível da catenação do ADN (por exemplo pela Topoisomerase II) poderiam prevenir a precoce separação dos cromatídeos irmãos. Pela realização deste projeto verificou-se que em células de pacientes WABS e células DDX11 KO a distribuição da Topoisomerase II se distribuída de forma homogénea por todo o cromossoma ao invés de um enriquecimento na zona centromérica. A partir dos resultados obtidos neste projeto, identificou-se um candidato promissor para a etiologia desta doença, no entanto muitas mais experiências são necessárias realizar no futuro para fortalecer estes resultados e nos permitir retirar conclusões finais sobre os mecanismos subjacentes a esta doença.
O ciclo celular é uma sequência de processos, pelos quais uma célula é capaz de crescer e se dividir em duas copias idênticas. Este processo pode ser dividido em duas grandes fases, a interfase, que é composta pela fase G1, S e G2 e a mitose, esta composta por seis estádios, a prófase, prometáfase, metáfase, anáfase, telófase e citocinese. De um modo simplista, pode-se dizer que a interfase é onde as células passa a maior parte da sua vida, crescem e duplicam o seu genoma para depois entrarem em mitose onde efetivamente a células divide o seu genoma duplicado nas duas células filhas de um modo equitativo. A passagem e cada fase do ciclo celular é altamente regulado para garantir que nenhum erro ocorra em nenhum dos processos, e que culmine com a formação de células com números anormais de cromossomas, isto é aneuploidia. A presença de um conteúdo genético anormal (quem em número ou organização) levam a que estas células tenham funções alteradas que na maioria são alterações nocivas para o organismo. Por isso, não é surpreendente que aneuploidia esteja tão frequentemente associadas a patologias como o cancro e doenças do desenvolvimento. A aneuploidia pode surgir por alterações ao nível ou durante a replicação do ADN ou por exemplo devido a agente exógenos mutagénicos. Durante a mitose, problemas ao nível na maquinaria do fuso mitótico, cinetócoros, centrossomas ou em estruturas cromossómicas podem levar a células aneuploides. Assim de modo impedir que estes erros ocorram há diversos mecanismos para proteger a célula, os chamados “checkpoints”, os quais estão distribuídos ao longo do ciclo. Estes têm o grande objetivo de garantir a integridade genómica das células, só deixando a célula progredir pelo ciclo se cumprir todos os requerimentos associados. Desde a replicação do ADN até a sua separação nas células filhas formadas, é necessário assegurar que cromatídeos irmãos se mantenham juntos. A coesina é um complexo proteico composto por 3 subunidades, a SMC1, a SMC3 e a Rad21, que forma um anel proteico que tem a capacidade de aprisionar ambas as cadeias de ADN irmãs, desta forma prevenindo que haja uma separação prematura dos dois cromatídeos irmãos. Nos últimos anos foi descoberto que a coesina é capaz de desempenhar funções em outras fases do ciclo celular, nomeadamente na regulação da expressão génica, na organização e integridade do genoma. Diversas patologias, como cancro ou síndromes raras têm associadas alterações nas subunidades da coesina ou nos seus reguladores. Aliás as coesinopatias é conjunto de síndromes raras que todas têm em comum o facto de todas serem originadas por problemas na coesina, ou nos seus cofatores e reguladores. Neste projeto procurou-se aprofundar o conhecimento dos mecanismos biológicos que levam ao desenvolvimento de uma coesinopatia chamada de Síndrome de rutura de Varsóvia (do inglês Warsaw Breakage Syndrome, tipicamente denominada por WABS). WABS é uma síndrome rara identificada pela primeira vez em 2010, sendo que até hoje apenas 23 casos foram reportados. Esta é causada por uma mutação bialélicas no gene que codifica a proteína DDX11, que é uma helicase de ADN e um cofator do loading coesina, embora se desconheça os mecanismos exatos. A etiologia desta doença ainda é desconhecida, mas duas hipóteses não mutuamente exclusivas são propostas: a primeira pressupõe problemas durante a replicação ou nos mecanismos de reparação do ADN são responsáveis pelo desenvolvimento da WABS. A segunda, sugere que problemas ao nível da segregação cromossómica duranta a mitose causa o desenvolvimento desta. Neste trabalho recorreu-se a linhas humanas para investigação a segunda hipótese, em particular células de fibroblastos obtida de dois indivíduos diagnosticados com WABS (e respetiva linha célula de controlo obtida de um individuo saudável), assim como a células RPE-1 modificadas geneticamente utilizando a técnica CRISPR no qual o gene DDX11 foi knockout. Assim, utilizando estas ferramentas testamos: (i) localização do DDX11 nas células WABS durante a mitose. Porém, devido a problemas de inespecificidade do anticorpo foi nos impossível retirar quaisquer conclusões sobre a localização e inferir sob a importância do DDX11 durante a mitose. (ii) Perceber a localização e distribuição, em cromossomas mitóticos, da cináse Aurora B, uma proteína necessária à correção e aferição da ligação entre os cromatídeos irmão e os microtúbulos do fuso mitótico prevenindo erros na segregação cromossómica. Num estudo prévio observou-se em células de galinha (DT40) que o knockout (KO) de DDX11 causa uma deslocalização desta proteína ao nível centromérico. Neste trabalho realizado, ao contrário do estudo prévio, observou-se um aumento da distribuição de Aurora B ao nível da região peri- e centromérica. Por fim, (iii) estudou-se a distribuição da enzima Topoisomerase II, uma responsável por resolver os emaranhamentos do ADN, que ocorrem de forma natural durante o processo de replicação do ADN. Sabe-se que a não expressão de DDX11 leva a baixos níveis da proteína coesina o que em certos contextos pode levar a uma separação precoce dos cromatídeos irmãos. Em células de indivíduos com WABS os nossos estudos laboratoriais mostraram que não era o caso, pelo que se colocou a hipótese que problemas ao nível da catenação do ADN (por exemplo pela Topoisomerase II) poderiam prevenir a precoce separação dos cromatídeos irmãos. Pela realização deste projeto verificou-se que em células de pacientes WABS e células DDX11 KO a distribuição da Topoisomerase II se distribuída de forma homogénea por todo o cromossoma ao invés de um enriquecimento na zona centromérica. A partir dos resultados obtidos neste projeto, identificou-se um candidato promissor para a etiologia desta doença, no entanto muitas mais experiências são necessárias realizar no futuro para fortalecer estes resultados e nos permitir retirar conclusões finais sobre os mecanismos subjacentes a esta doença.
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Síndrome de rutura de varsóvia (do inglês warsaw breakage syndrome Wabs DDX11 Coesinopatias Coesina Aurora B Topoisomerase ii