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Publication
Molecular tools to study SCA2: from new advanced disease models to CRISPR-mediated editing approaches
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Abstract(s)
Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a rare neurodegenerative disease caused by an abnormal expansion of the trinucleotide CAG in the coding region of ATXN2. This overexpanded CAG region is translated into an abnormally long tract of glutamines within the ATXN2 protein, which above 32 repetitions drives pathology. SCA2 comprehends a complex network of pathological mechanisms, progressively leading to neuronal dysfunction and cell death. As a result of the expanded ATXN2-mediated neurodegeneration, especially affecting the cerebellum and the brainstem, SCA2 patients suffer from several motor and non-motor signs and symptoms, with ataxia as the most frequent. Currently, there is no therapy capable of delaying or stopping disease progression, leading to the premature death of patients. Disease models have proven to be a valuable tool for the study of the pathological mechanisms underlying SCA2. In this work we develop a new transgenic mouse model for SCA2 with early motor and neuropathologic phenotype to study the role of the ATXN2 expanded protein in the pathogenesis of the disease. Additionally, we generated a SCA2 patient-derived iPSC line to serve as a platform to test new advanced therapeutic strategies. Taking advantage
of the CRISPR toolbox to manipulate gene expression, we designed three CRISPRbased strategies targeting the ATXN2 gene: a CRISPR-Cas9 indel directing the nuclease activity of Cas9 to an early site of the ATXN2 gene; a CRISPRi using the dCas9-KRAB complex to hinder transcription; and a CRISPR-Cas9 excision directing Cas9 to two sites of the ATXN2 to excise the CAG region. We tested these strategies in the newly generated SCA2 patient-derived iPSC line, inducing its differentiation into mature neurons. The CRISPR strategies resulted in a decrease of the ATXN2 protein levels or the complete ablation of ATXN2 expression, preventing several pathological traits of SCA2. The tools developed in this project support the development of CRISPR-based disease-modifying strategies for SCA2, enlightening the action of ATXN2-mediated pathogenesis.
A ataxia espinocerebelosa tipo 2 (em inglês SCA2) é uma doença neurodegenerativa rara causada pela expansão anormal do trinucleótido CAG na região codificante do gene ATXN2. A região CAG expandida é traduzida na proteína ATXN2 contendo um segmento de glutaminas anormalmente longo, o qual se torna patológico acima de 32 repetições. A SCA2 engloba uma complexa rede de mecanismos patológicos que progressivamente se refletem em disfunção neuronal e morte celular. Como resultado da neurodegenerescência mediada pela ATXN2 expandida, afetando maioritariamente o cerebelo e o tronco cerebral, os doentes com SCA2 padecem de uma variedade de sinais e sintomas motores e não-motores, sendo a ataxia o sintoma mais frequente. Atualmente, não existe nenhuma estratégia terapêutica capaz de parar ou atrasar a progressão da doença, refletindo-se na morte prematura dos doentes. A utilização de diferentes modelos de doenças, desde leveduras até roedores, contribuiu significativamente para desvendar os mecanismos moleculares pelos quais a SCA2 é estabelecida, no entanto, estes ainda não estão completamente compreendidos. Existe, portanto, a necessidade de desenvolver modelos de doenças relevantes que recapitulem fielmente o fenótipo neuropatológico e motor humano de SCA2. Infelizmente, os modelos de murganho atualmente desenvolvidos para a SCA2 não conseguem reproduzir algumas das características patológicas da mesma, que são essenciais ao estudo e ao desenvolvimento de terapias modificadoras da doença. No decurso deste projeto foi desenvolvido um novo modelo transgénico para SCA2 em murganho, contendo 129 glutaminas na forma humana da proteína ATXN2. Este modelo foi extensivamente caracterizado ao nível neuropatológico e motor. A nossa bateria de avaliação de comportamento motor que inclui coordenação, resistência, equilíbrio, contração dos membros e desempenho motor, revelou fenótipo de SCA2 a partir das 12 semanas de idade. Neuropatologicamente, há uma redução na espessura da camada granular dos lobos cerebelosos às 4 semanas de idade e uma redução no número total de células de Purkinje às 48 semanas de idade, refletindo a natureza progressiva da doença. Deste modo, este modelo é uma ferramenta valiosa para estudar o impacto da proteína ATXN2 expandida na cascata patológica da doença e constitui uma plataforma para o teste de estratégias terapêuticas preventivas ou de longo prazo direcionadas à proteína expandida e aos mecanismos desencadeados pela sua expressão. Apesar de os modelos animais contribuírem para o avanço significativo da compreensão dos mecanismos de doença subjacentes à SCA2, as diferenças fisiológicas e genéticas entre animais e humanos não podem ser ignoradas e podem contribuir para o insucesso nos ensaios clínicos. As células estaminais pluripotentes induzidas humanas (em inglês iPSCs) são uma ferramenta valiosa para o screening de alvos terapêuticos, dado que podem ser diferenciadas em diferentes tipos celulares e, assim, serem modelos de doenças in vitro. Assim, um dos nossos objetivos foi gerar uma nova linha de iPSC derivadas de um doente de SCA2 para ser posteriormente utilizada para testar estratégias terapêuticas num modelo de doença geneticamente relevante. Para isso, fibroblastos de pele de um doente do sexo masculino diagnosticado clinicamente com 22/44 repetições de CAG foram reprogramados em iPSCs recorrendo à expressão dos fatores de Yamanaka através do vetor Sendai virus. A nova linha foi diferenciada em NPCs, e subsequentemente em neurónios, e recapitulou características patológicas de SCA2 ao nível morfológico, bem a presença de agregados de poliglutamina expandidos dentro do citoplasma das células. Notavelmente, a expressão de ATXN2 é maior em neurónios derivados de iPSCs do que em NPCs ou iPSCs. Esta nova linha de iPSC de SCA2 pode ser usada para estudar a SCA2 in vitro no contexto genético da doença humana, servindo como plataforma para testar estratégias terapêuticas para modificar o curso da doença, com foco nas células neuronais. Um dos principais objetivos deste projeto foi o desenvolvimento de estratégias baseadas em CRISPR para modificar o curso patológico da SCA2, tendo como alvo o gene ATXN2. O sistema CRISPR-Cas é uma plataforma simples, mas versátil, capaz de alterar o genoma com alta precisão. Deste modo, é possível silenciar, substituir ou corrigir um gene causador de doença, ou até modular a expressão de um gene. Foram, então, desenhadas três estratégias baseadas em CRISPR: a CRISPR-Cas9 indel que se baseia na atividade catalítica da Cas9 direcionada para um local inicial do gene ATXN2; a CRISPRi que utiliza o complexo dCas9-KRAB para suster a transcrição de ATXN2; a CRISPR-Cas9 excisão que direciona a Cas9 para dois locais do ATXN2, excisando a região CAG. Estas estratégias foram testadas na nova linha iPSC derivada de um doente de SCA2, induzindo posteriormente a sua diferenciação em neurónios maduros. Todas as linhas isogénicas editadas com CRISPR ou com a repressão da transcrição de ATXN2, expressaram os marcadores normais de pluripotência e retiveram a capacidade de se diferenciar em células da ectoderme, nomeadamente em NPCs e posteriormente em neurónios maduros. Astrócitos também foram derivados da diferenciação e maturação de NPCs, coexistindo com os neurónios em cultura. A estratégia mais eficiente em silenciar tanto o mRNA como a proteína foi a estratégia CRISPRi. Embora não totalmente, as outras duas estratégias mostram uma redução marcada na expressão de ATXN2, resultando em um fenótipo patológico menos pronunciado. No entanto, o impacto das estratégias de edição precisa de ser confirmado em mais experiências, dada a natureza aleatória dos mecanismos celulares de reparação do DNA. A estratégia CRISPR-Cas9 indel foi testada num modelo in vivo de patologia estriatal, revelando reduzir o número de células com agregados de ATXN2. Contudo o teste desta estratégia em modelos transgénicos de SCA2 contribuiria para avaliar o nível de prevenção do aparecimento do fenótipo motor. Além disso, o acesso a mais amostras de doentes também seria um recurso valioso para testar estas estratégias num grupo mais heterogéneo de SCA2. As ferramentas desenvolvidas neste projeto contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos patológicos derivados da ATXN2 expandida subjacentes à progressão de SCA2, tanto ao nível do organismo, in vivo, como ao nível neuronal, in vitro. Os recentes avanços das terapias com CRISPR em direção ao mercado, resultando no primeiro tratamento aprovado de edição com CRISPR-Cas9, no final de 2023, abriram as portas para o aumento do desenvolvimento de terapias baseadas em CRISPR para uso clínico. Ao aliar estas estratégias com modelos de doença é desbloqueado um enorme potencial para a descoberta de mecanismos e alvos terapêuticos para as doenças neurodegenerativas, levando-nos mais perto de encontrar uma terapia eficaz e de longo prazo para a SCA2.
A ataxia espinocerebelosa tipo 2 (em inglês SCA2) é uma doença neurodegenerativa rara causada pela expansão anormal do trinucleótido CAG na região codificante do gene ATXN2. A região CAG expandida é traduzida na proteína ATXN2 contendo um segmento de glutaminas anormalmente longo, o qual se torna patológico acima de 32 repetições. A SCA2 engloba uma complexa rede de mecanismos patológicos que progressivamente se refletem em disfunção neuronal e morte celular. Como resultado da neurodegenerescência mediada pela ATXN2 expandida, afetando maioritariamente o cerebelo e o tronco cerebral, os doentes com SCA2 padecem de uma variedade de sinais e sintomas motores e não-motores, sendo a ataxia o sintoma mais frequente. Atualmente, não existe nenhuma estratégia terapêutica capaz de parar ou atrasar a progressão da doença, refletindo-se na morte prematura dos doentes. A utilização de diferentes modelos de doenças, desde leveduras até roedores, contribuiu significativamente para desvendar os mecanismos moleculares pelos quais a SCA2 é estabelecida, no entanto, estes ainda não estão completamente compreendidos. Existe, portanto, a necessidade de desenvolver modelos de doenças relevantes que recapitulem fielmente o fenótipo neuropatológico e motor humano de SCA2. Infelizmente, os modelos de murganho atualmente desenvolvidos para a SCA2 não conseguem reproduzir algumas das características patológicas da mesma, que são essenciais ao estudo e ao desenvolvimento de terapias modificadoras da doença. No decurso deste projeto foi desenvolvido um novo modelo transgénico para SCA2 em murganho, contendo 129 glutaminas na forma humana da proteína ATXN2. Este modelo foi extensivamente caracterizado ao nível neuropatológico e motor. A nossa bateria de avaliação de comportamento motor que inclui coordenação, resistência, equilíbrio, contração dos membros e desempenho motor, revelou fenótipo de SCA2 a partir das 12 semanas de idade. Neuropatologicamente, há uma redução na espessura da camada granular dos lobos cerebelosos às 4 semanas de idade e uma redução no número total de células de Purkinje às 48 semanas de idade, refletindo a natureza progressiva da doença. Deste modo, este modelo é uma ferramenta valiosa para estudar o impacto da proteína ATXN2 expandida na cascata patológica da doença e constitui uma plataforma para o teste de estratégias terapêuticas preventivas ou de longo prazo direcionadas à proteína expandida e aos mecanismos desencadeados pela sua expressão. Apesar de os modelos animais contribuírem para o avanço significativo da compreensão dos mecanismos de doença subjacentes à SCA2, as diferenças fisiológicas e genéticas entre animais e humanos não podem ser ignoradas e podem contribuir para o insucesso nos ensaios clínicos. As células estaminais pluripotentes induzidas humanas (em inglês iPSCs) são uma ferramenta valiosa para o screening de alvos terapêuticos, dado que podem ser diferenciadas em diferentes tipos celulares e, assim, serem modelos de doenças in vitro. Assim, um dos nossos objetivos foi gerar uma nova linha de iPSC derivadas de um doente de SCA2 para ser posteriormente utilizada para testar estratégias terapêuticas num modelo de doença geneticamente relevante. Para isso, fibroblastos de pele de um doente do sexo masculino diagnosticado clinicamente com 22/44 repetições de CAG foram reprogramados em iPSCs recorrendo à expressão dos fatores de Yamanaka através do vetor Sendai virus. A nova linha foi diferenciada em NPCs, e subsequentemente em neurónios, e recapitulou características patológicas de SCA2 ao nível morfológico, bem a presença de agregados de poliglutamina expandidos dentro do citoplasma das células. Notavelmente, a expressão de ATXN2 é maior em neurónios derivados de iPSCs do que em NPCs ou iPSCs. Esta nova linha de iPSC de SCA2 pode ser usada para estudar a SCA2 in vitro no contexto genético da doença humana, servindo como plataforma para testar estratégias terapêuticas para modificar o curso da doença, com foco nas células neuronais. Um dos principais objetivos deste projeto foi o desenvolvimento de estratégias baseadas em CRISPR para modificar o curso patológico da SCA2, tendo como alvo o gene ATXN2. O sistema CRISPR-Cas é uma plataforma simples, mas versátil, capaz de alterar o genoma com alta precisão. Deste modo, é possível silenciar, substituir ou corrigir um gene causador de doença, ou até modular a expressão de um gene. Foram, então, desenhadas três estratégias baseadas em CRISPR: a CRISPR-Cas9 indel que se baseia na atividade catalítica da Cas9 direcionada para um local inicial do gene ATXN2; a CRISPRi que utiliza o complexo dCas9-KRAB para suster a transcrição de ATXN2; a CRISPR-Cas9 excisão que direciona a Cas9 para dois locais do ATXN2, excisando a região CAG. Estas estratégias foram testadas na nova linha iPSC derivada de um doente de SCA2, induzindo posteriormente a sua diferenciação em neurónios maduros. Todas as linhas isogénicas editadas com CRISPR ou com a repressão da transcrição de ATXN2, expressaram os marcadores normais de pluripotência e retiveram a capacidade de se diferenciar em células da ectoderme, nomeadamente em NPCs e posteriormente em neurónios maduros. Astrócitos também foram derivados da diferenciação e maturação de NPCs, coexistindo com os neurónios em cultura. A estratégia mais eficiente em silenciar tanto o mRNA como a proteína foi a estratégia CRISPRi. Embora não totalmente, as outras duas estratégias mostram uma redução marcada na expressão de ATXN2, resultando em um fenótipo patológico menos pronunciado. No entanto, o impacto das estratégias de edição precisa de ser confirmado em mais experiências, dada a natureza aleatória dos mecanismos celulares de reparação do DNA. A estratégia CRISPR-Cas9 indel foi testada num modelo in vivo de patologia estriatal, revelando reduzir o número de células com agregados de ATXN2. Contudo o teste desta estratégia em modelos transgénicos de SCA2 contribuiria para avaliar o nível de prevenção do aparecimento do fenótipo motor. Além disso, o acesso a mais amostras de doentes também seria um recurso valioso para testar estas estratégias num grupo mais heterogéneo de SCA2. As ferramentas desenvolvidas neste projeto contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos patológicos derivados da ATXN2 expandida subjacentes à progressão de SCA2, tanto ao nível do organismo, in vivo, como ao nível neuronal, in vitro. Os recentes avanços das terapias com CRISPR em direção ao mercado, resultando no primeiro tratamento aprovado de edição com CRISPR-Cas9, no final de 2023, abriram as portas para o aumento do desenvolvimento de terapias baseadas em CRISPR para uso clínico. Ao aliar estas estratégias com modelos de doença é desbloqueado um enorme potencial para a descoberta de mecanismos e alvos terapêuticos para as doenças neurodegenerativas, levando-nos mais perto de encontrar uma terapia eficaz e de longo prazo para a SCA2.
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Keywords
Ataxia espinocerebelosa tipo 2 Sistema CRISPR-Cas; Terapia génica Modelos de doença em iPSCs Modelos transgénicos em murganho