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Publication
ClockOME: searching for oscillatory genes in early vertebrate development
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Abstract(s)
Embryo development is a dynamic process regulated in space and time. Cells must
integrate biochemical and mechanical signals to generate fully functional organisms, where
oscillatory gene expression plays a key role. The embryo molecular clock (EMC) is the best
known genetic oscillator active in embryo segmentation, involving genes from the Notch, FGF,
and WNT pathways. However, the list of cyclic genes is still incomplete mostly due to the
challenges involved with studying periodic systems. Recently, such studies have become more
feasible with the development of pseudo-time ordering algorithms that search for candidate
oscillatory genes using large transcriptomics datasets sampled without explicit time
measurements.
This study aims at finding candidate oscillatory genes - ClockOME - active in early
chick embryo development.
Two Gallus gallus microarray transcriptomics datasets from Presomitic mesoderm
(PSM), and one dataset from limb segmentation were gathered from GEO and ArrayExpress.
To normalize these data from different experiments, an RData package - FrozenChicken - was
developed to apply a frozen Robust MultiArray (fRMA) normalization to the data. Next the
datasets were processed with Oscope (a pseudo-time ordering algorithm) to search for candidate
periodic genes clustered by similar oscillatory behaviour. The clusters of predicted oscillators
were then subject to functional enrichment and interaction network analyses to highlight the
biological functions associated with these genes. Oscope predicted three clusters of oscillators:
two in PSM (106 and 32 genes), and one in Limb (162 genes). Overall, the genes are associated
with regulatory, morphological, and developmental processes. Mesp2, a gene involved with the
EMC, was found in this dataset, validating the approach, however, the majority of genes are
novel oscillatory candidates, associated with chromatin and transcriptional regulation, as well
as protein and oxygen metabolism. The list of candidate oscillators represents a valuable
resource for guided experimental validation to discover additional members of the chick EMC.
Six genes have been proposed for high-priority experimental validation: SRC, PTCH1,
NOTCH2, YAP1, KDR, CTR9.
O desenvolvimento embrionário é um processo dinâmico que envolve alterações moleculares no espaço e no tempo. As células embrionárias são constantemente expostas a estímulos bioquímicos e mecânicos, e respondem ao ambiente em que se encontram alterando o seu programa genético. Quando corretamente integradas, estas respostas celulares culminam com o desenvolvimento bem-sucedido de um organismo funcional. Assim, a embriogénese envolve processos moleculares estritamente regulados, sendo a expressão oscilatória de genes uma das formas possíveis para a regulação do comportamento das células ao longo do tempo. O relógio molecular embrionário é um conhecido oscilador genético, e está envolvido na segmentação do tecido paraxial embrionário. O conceito de relógio molecular foi inicialmente proposto em 1976 por Cooke e Zeeman, ao qual chamaram o modelo Clock and Wavefront (Relógio e Frente de Onda)1. Este modelo foi concebido para descrever teoricamente a formação rítmica de sómitos em ambos os lados da mesoderme paraxial (PSM) nos vertebrados, e baseia-se na existência de osciladores genéticos que regulam esse processo de segmentação da PSM ao longo do tempo. Para além do relógio, como diz o nome, o modelo inclui a existência de uma frente de onda, que determina espacialmente o comportamento das células presentes na mesoderme pré-somítica (PSM). Assim, os dois mecanismos guiam a diferenciação das células da PSM, que consequentemente sofrem transformações genéticas que precedem a formação dos sómitos. A base deste relógio molecular consiste na expressão periódica de genes que fazem parte das vias moleculares Notch, FGF e WNT. Contudo, a lista de genes envolvidos no relógio embrionário ainda não se encontra completa, facto este que se deve principalmente às dificuldades experimentais relacionadas com o estudo de sistemas periódicos quando não se conhece de antemão a periodicidade/ritmo da expressão dos genes envolvidos. Com o advento de novas técnicas de transcriptómica que permitem o estudo dos valores de expressão de todos os genes simultaneamente, nomeadamente usando Microarrays, ou mais recentemente através de métodos de sequenciação, como RNA-sequencing ou Single-Cell RNA-sequencing, surge a oportunidade de procurar alargar a lista de genes com expressão oscilatória. Porém, estes métodos implicam a extração do RNA das células amostradas resultando na morte celular. Assim, este processamento inviabiliza o estudo das mesmas células ao longo do tempo, originando dados moleculares estáticos, isto é, os níveis de expressão obtidos representam uma única amostra temporal. Para o estudo de processos periódicos, seria então necessário fazer uma série temporal amostrando diferentes indivíduos ao longo do tempo de desenvolvimento, aumentando grandemente o número de amostras biológicas necessárias para resolver o ciclo de oscilação para cada gene estudado. Assim, sem informação temporal medida explicitamente, a expressão oscilatória de genes pode apenas ser estudada usando modelos matemáticos apropriados, nomeadamente através da aplicação de algoritmos de ordenação pseudo-temporal. Estes métodos ordenam as amostras ao longo do tempo de uma oscilação de forma a obter o padrão do comportamento cíclico para todos os genes cuja expressão oscila concomitantemente. Torna-se assim possível, bioinformaticamente, inferir o potencial oscilatório de genes medidos por estas técnicas de transcriptómica, sem informação temporal explícita. Deste modo, o objetivo deste estudo é encontrar novos genes oscilatórios, a que coletivamente chamamos ClockOME, que estão ativos durante as primeiras etapas do desenvolvimento embrionário (somitogénese) da galinha, nos tecidos da mesoderme présomítica (PSM), e no membro superior (Limb); tecidos estes onde o relógio molecular foi descrito, atuando como regulador temporal das alterações genéticas subjacentes. Para tal, recolheu-se 3 conjuntos de dados (datasets) de transcriptómica obtidos por microarray de dois repositórios de dados públicos: GEO (da instituição americana NCBI) e ArrayExpress (da instituição europeia EMBL-EBI). Dois datasets continham dados de mesoderme paraxial (PSM) – tecido onde ocorre a somitogénese; e um dataset de dados de obtidos do membro superior do embrião de galinha. Com o objetivo de normalizar os três datasets de forma a torná-los comparáveis (uma vez que são oriundos de processos experimentais diferentes), foi desenvolvido um pacote de R denominado “FrozenChicken: Promoting the meta-analysis of chicken microarray data” (publicado em 2021) (https://doi.org/10.1101/2021.02.25.432894). Este pacote contém dados sumarizados de 472 datasets de microarrays de embriões de galinha, tornando possível a normalização por fRMA (frozen Robust MultiArray) de microarrays de Gallus gallus. Após normalização e controlo de qualidade dos valores de expressão genética, os dados da PSM e do membro foram processados com o Oscope (algoritmo de ordenação pseudo-temporal), com o propósito de prever genes oscilatórios. Este algoritmo avalia todas as combinações de pares de genes, agrupando aqueles que apresentem padrões de expressão semelhantes, ou seja, cujos valores de expressão ao longo das amostras seguem trajetórias semelhantes, indiciando um período de oscilação potencialmente semelhante. Os clusters de genes previstos pelo Oscope foram posteriormente submetidos a uma análise de enriquecimento funcional e a uma análise de interações funcionais, com o intuito de perceber o seu potencial papel biológico, e funções moleculares subjacentes. O Oscope reportou três listas de genes potencialmente oscilatórios: dois grupos foram encontrados a partir dos dados da PSM (com 106 e 32 genes cada) e o terceiro grupo de 162 genes foi encontrado nos dados do membro superior. No total, a lista de genes que denominamos ClockOME é composta por 296 genes potencialmente oscilatórios, envolvidos em diversos mecanismos regulatórios importantes para o desenvolvimento embrionário e para a morfogénese. A maioria dos genes presentes nesta lista não estão descritos na literatura como sendo oscilatórios (novel candidates), representando, portanto, uma mais-valia para a comunidade científica que estuda o relógio molecular embrionário. Estes genes parecem estar associados a funções como remodelação da cromatina, regulação da transcrição, metabolismo proteico e metabolismo do oxigénio, sendo, portanto, bons candidatos para futura validação experimental. Notavelmente, o Oscope identificou com sucesso o Mesp2, um gene oscilatório bem descrito na literatura, mostrando assim a validade e o potencial desta abordagem teórica. Em suma, este trabalho produziu uma lista de 296 genes potencialmente oscilatórios. Com base na sua novidade e na função molecular anotada, foi proposta uma lista de seis genes candidatos de particular relevância para validação experimental no futuro próximo, nomeadamente: SRC, PTCH1, NOTCH2, YAP1, KDR, CTR9. Assim, as listas resultantes do trabalho desta tese poderão agora guiar futuras experiências laboratoriais capazes de adicionar novos interactores moleculares ao atual modelo do relógio molecular embrionário.
O desenvolvimento embrionário é um processo dinâmico que envolve alterações moleculares no espaço e no tempo. As células embrionárias são constantemente expostas a estímulos bioquímicos e mecânicos, e respondem ao ambiente em que se encontram alterando o seu programa genético. Quando corretamente integradas, estas respostas celulares culminam com o desenvolvimento bem-sucedido de um organismo funcional. Assim, a embriogénese envolve processos moleculares estritamente regulados, sendo a expressão oscilatória de genes uma das formas possíveis para a regulação do comportamento das células ao longo do tempo. O relógio molecular embrionário é um conhecido oscilador genético, e está envolvido na segmentação do tecido paraxial embrionário. O conceito de relógio molecular foi inicialmente proposto em 1976 por Cooke e Zeeman, ao qual chamaram o modelo Clock and Wavefront (Relógio e Frente de Onda)1. Este modelo foi concebido para descrever teoricamente a formação rítmica de sómitos em ambos os lados da mesoderme paraxial (PSM) nos vertebrados, e baseia-se na existência de osciladores genéticos que regulam esse processo de segmentação da PSM ao longo do tempo. Para além do relógio, como diz o nome, o modelo inclui a existência de uma frente de onda, que determina espacialmente o comportamento das células presentes na mesoderme pré-somítica (PSM). Assim, os dois mecanismos guiam a diferenciação das células da PSM, que consequentemente sofrem transformações genéticas que precedem a formação dos sómitos. A base deste relógio molecular consiste na expressão periódica de genes que fazem parte das vias moleculares Notch, FGF e WNT. Contudo, a lista de genes envolvidos no relógio embrionário ainda não se encontra completa, facto este que se deve principalmente às dificuldades experimentais relacionadas com o estudo de sistemas periódicos quando não se conhece de antemão a periodicidade/ritmo da expressão dos genes envolvidos. Com o advento de novas técnicas de transcriptómica que permitem o estudo dos valores de expressão de todos os genes simultaneamente, nomeadamente usando Microarrays, ou mais recentemente através de métodos de sequenciação, como RNA-sequencing ou Single-Cell RNA-sequencing, surge a oportunidade de procurar alargar a lista de genes com expressão oscilatória. Porém, estes métodos implicam a extração do RNA das células amostradas resultando na morte celular. Assim, este processamento inviabiliza o estudo das mesmas células ao longo do tempo, originando dados moleculares estáticos, isto é, os níveis de expressão obtidos representam uma única amostra temporal. Para o estudo de processos periódicos, seria então necessário fazer uma série temporal amostrando diferentes indivíduos ao longo do tempo de desenvolvimento, aumentando grandemente o número de amostras biológicas necessárias para resolver o ciclo de oscilação para cada gene estudado. Assim, sem informação temporal medida explicitamente, a expressão oscilatória de genes pode apenas ser estudada usando modelos matemáticos apropriados, nomeadamente através da aplicação de algoritmos de ordenação pseudo-temporal. Estes métodos ordenam as amostras ao longo do tempo de uma oscilação de forma a obter o padrão do comportamento cíclico para todos os genes cuja expressão oscila concomitantemente. Torna-se assim possível, bioinformaticamente, inferir o potencial oscilatório de genes medidos por estas técnicas de transcriptómica, sem informação temporal explícita. Deste modo, o objetivo deste estudo é encontrar novos genes oscilatórios, a que coletivamente chamamos ClockOME, que estão ativos durante as primeiras etapas do desenvolvimento embrionário (somitogénese) da galinha, nos tecidos da mesoderme présomítica (PSM), e no membro superior (Limb); tecidos estes onde o relógio molecular foi descrito, atuando como regulador temporal das alterações genéticas subjacentes. Para tal, recolheu-se 3 conjuntos de dados (datasets) de transcriptómica obtidos por microarray de dois repositórios de dados públicos: GEO (da instituição americana NCBI) e ArrayExpress (da instituição europeia EMBL-EBI). Dois datasets continham dados de mesoderme paraxial (PSM) – tecido onde ocorre a somitogénese; e um dataset de dados de obtidos do membro superior do embrião de galinha. Com o objetivo de normalizar os três datasets de forma a torná-los comparáveis (uma vez que são oriundos de processos experimentais diferentes), foi desenvolvido um pacote de R denominado “FrozenChicken: Promoting the meta-analysis of chicken microarray data” (publicado em 2021) (https://doi.org/10.1101/2021.02.25.432894). Este pacote contém dados sumarizados de 472 datasets de microarrays de embriões de galinha, tornando possível a normalização por fRMA (frozen Robust MultiArray) de microarrays de Gallus gallus. Após normalização e controlo de qualidade dos valores de expressão genética, os dados da PSM e do membro foram processados com o Oscope (algoritmo de ordenação pseudo-temporal), com o propósito de prever genes oscilatórios. Este algoritmo avalia todas as combinações de pares de genes, agrupando aqueles que apresentem padrões de expressão semelhantes, ou seja, cujos valores de expressão ao longo das amostras seguem trajetórias semelhantes, indiciando um período de oscilação potencialmente semelhante. Os clusters de genes previstos pelo Oscope foram posteriormente submetidos a uma análise de enriquecimento funcional e a uma análise de interações funcionais, com o intuito de perceber o seu potencial papel biológico, e funções moleculares subjacentes. O Oscope reportou três listas de genes potencialmente oscilatórios: dois grupos foram encontrados a partir dos dados da PSM (com 106 e 32 genes cada) e o terceiro grupo de 162 genes foi encontrado nos dados do membro superior. No total, a lista de genes que denominamos ClockOME é composta por 296 genes potencialmente oscilatórios, envolvidos em diversos mecanismos regulatórios importantes para o desenvolvimento embrionário e para a morfogénese. A maioria dos genes presentes nesta lista não estão descritos na literatura como sendo oscilatórios (novel candidates), representando, portanto, uma mais-valia para a comunidade científica que estuda o relógio molecular embrionário. Estes genes parecem estar associados a funções como remodelação da cromatina, regulação da transcrição, metabolismo proteico e metabolismo do oxigénio, sendo, portanto, bons candidatos para futura validação experimental. Notavelmente, o Oscope identificou com sucesso o Mesp2, um gene oscilatório bem descrito na literatura, mostrando assim a validade e o potencial desta abordagem teórica. Em suma, este trabalho produziu uma lista de 296 genes potencialmente oscilatórios. Com base na sua novidade e na função molecular anotada, foi proposta uma lista de seis genes candidatos de particular relevância para validação experimental no futuro próximo, nomeadamente: SRC, PTCH1, NOTCH2, YAP1, KDR, CTR9. Assim, as listas resultantes do trabalho desta tese poderão agora guiar futuras experiências laboratoriais capazes de adicionar novos interactores moleculares ao atual modelo do relógio molecular embrionário.
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Keywords
Expressão oscilatória de genes Desenvolvimento embrionário Gallus gallus Relógio molecular embrionário Transcriptómica Algoritmo de ordenação pseudo-temporal