Study of the application potential of synthetic and natural polymeric coatings in stem cell research

Abstract

Self-renewability and the ability to differentiate into various functional cells are characteristics of embryonic stem cells (ESCs) that make them attractive for applications in biomedical field, namely in restoring the function of damaged cells/tissues. In research, ESCs are usually cultured in gelatin or over a monolayer of mitotically inactivated mouse embryonic fibroblasts (MEFsi). The latter is the gold standard to maintain pluripotent ESCs in culture. A variety of alternative technologies have been suggested to control stem cell fate and function, but examples of versatile, non-animal derived and inexpensive materials able to support pluripotent ESCs are limited. To circumvent this, we aimed to find a biomaterial able to support pluripotent ESC cultures that would avoid the laborious and time consuming parallel culture of MEFsi and as simple to handle as gelatin. There is an increasing interest in regulating stem cells under a specific microenvironment using biomaterials as artificial extracellular matrices (ECMs) to control their self-renewability and differentiation capacity. In the present work we developed and tested the applicability of two biomaterials, one natural and one synthetic polymer, to support mouse ESC (mESC) culture. Accordingly, undifferentiated mESCs were cultured in coatings of Locust Bean Gum (LGB) and of a new synthetic nanofiber (nf) material based on the self-assembly of a triblock copolymer, poly (ethyleneglycol-β-trimethylsilyl methacrylate-β-methacrylic acid), conjugated with the peptide Glycine-Arginine-Glycine-Aspartate-Serine. According to our data, compared to conventional stem cell culture methodologies, ESCs grown in LBG and nanofiber coatings maintained their self-renewability and trilineage differentiation capacity even after long term culture. In parallel, this work also comprises the functional study of collagen and calciumbinding EGF domains 1 (Ccbe1) using primary fibroblasts as a tool. It has been shown that Ccbe1 is involved in lymphangiogenesis, cardiogenesis and carcinogenesis, however, its function and molecular action remains unknown. The data presented here suggests that Ccbe1 coordinates cell adhesion, migration and proliferation, thus playing a key role in the ECM.

A investigação em células estaminais embrionárias tem permitido grandes avanços na pesquisa em ciências biomédicas. Este é o evidente reflexo de estas serem células não especializadas que são capazes de se auto-renovar indefinidamente, e assim dar origem a novas células estaminais num estado indiferenciado, mas também têm a possibilidade de se diferenciarem em um ou múltiplos tipos de células especializadas sob condições definidas ou estímulos intrínsecos e/ou extrínsecos. Linhas de células estaminais embrionárias de ratinho foram inicialmente derivadas e cultivadas há cerca de 30 anos e, desde então, têm sido uma ferramenta inestimável na compreensão dos processos de desenvolvimento embrionário dos mamíferos, bem como no estabelecimento das bases moleculares da pluripotência e da auto-renovação celular. Para além disso, por permitir a criação de geneticamente modificados (e.g. knock-outs) através de recombinação homóloga, estas são determinantes no estudo da função genética in vivo. Não menos importante, os estudos das células estaminais embrionárias de ratinho abriram o caminho à investigação das células estaminais embrionárias humanas que, dada a sua capacidade de auto-renovação e diferenciação, têm suscitado muito interesse pelo seu elevado potencial para uso em terapia celular. As células estaminais embrionárias têm sido co-cultivadas geralmente com células de suporte tais como fibroblastos embrionários de ratinho. Os fibroblastos embrionários de ratinho servem de células de suporte para cultura de células estaminais embrionárias desde a derivação das mesmas. Estes fibroblastos continuam a ser ainda hoje os mais usados como células de suporte para cultura e manutenção de células estaminais de ratinho e humanas, uma vez que proporcionam um substrato que aumenta a eficiência de adesão das células estaminais, promove a manutenção da sua pluripotência e capacidade de auto-renovação e facilita a sua sobrevivência e crescimento. Os fibroblastos embrionários usados para cultura de células estaminais produzem uma complexa mistura de fatores de crescimento, citoquinas e outros componentes da matriz extracelular tais como o fator inibidor de leucemia, proteínas morfogenéticas ósseas, activina, laminina e vitronectina, que mantêm as células estaminais embrionárias indiferenciadas e pluripotentes mesmo quando cultivadas a longo prazo. Sabe-se que o comportamento das células estaminais embrionárias in vitro é fortemente influenciadas pelas condições de cultura. Estudos recentes demonstram que os métodos convencionais de cultura de células estaminais não reúnem os requisitos mínimos para regular e controlar com rigor a função das células estaminais. Além disso, os vários protocolos existentes para cultura de células estaminais envolvem o uso de matrizes de origem animal, tais como a gelatina e os fibroblastos de ratinho. De modo a ultrapassar esta limitação, vários cientistas têm-se empenhado em desenvolver matrizes artificiais no sentido de eliminar os componentes de origem animal dos sistemas de cultura de células, mas mantendo o controlo da capacidade de auto-renovação e diferenciação das células estaminais. O avanço no desenvolvimento de biomateriais tem-se revelado uma ferramenta fundamental para a criação de microambientes artificiais que visam mimetizar o microambiente in vivo das células estaminais, influenciando e controlando a expressão dos genes que definem o destino e as propriedades estaminais, ou seja, a auto-renovação ou a diferenciação. No entanto, apesar dos grandes avanços que têm ocorrido no desenvolvimento de biomateriais, a maioria são dispendiosos e poucos são apropriados para manter as células estaminais embrionárias num estado indiferenciado. Por isso, o objetivo principal deste trabalho foi o de encontrar ou desenvolver um biomaterial capaz de dar suporte ao crescimento de células estaminais embrionárias indiferenciadas, evitando os custos de uma série de procedimentos experimentais trabalhosos e morosos da cultura paralela de fibroblastos com a cultura de células estaminais, e que fosse de fácil manuseamento tal como a gelatina. Visto que o ambiente que envolve as células estaminais tem um papel determinante na seleção do destino das mesmas, o objetivo deste trabalho consistiu então em otimizar as condições de cultura de células estaminais embrionárias de ratinho através da substituição da monocamada de fibroblastos ou da gelatina por um suporte artificial que mimetizasse a matriz extracelular e que servisse como substrato para adesão celular, proliferação e diferenciação. No âmbito deste trabalho desenvolveu-se e testou-se a aplicabilidade de um revestimento de goma de semente de alfarroba e de uma matriz de nanofibras sintéticas na manutenção da pluripotência e capacidade de diferenciação de células estaminais embrionárias de ratinho em cultura. A estabilidade química e a biocompatibilidade dos biomateriais de origem natural tem contribuído para a sua utilização cada vez mais frequente na medicina moderna. A goma de semente de alfarroba é um polímero natural que tem uma vasta gama de aplicações desde a indústria alimentar e cosmética, passando também pela farmacêutica devido à sua biocompatibilidade e às suas propriedades de adesão e de espessante. Nós quisemos testar este composto natural na cultura de células estaminais pluripotentes. Numa primeira abordagem, células estaminais embrionárias de ratinho foram cultivadas em poliestireno revestido com goma de semente de alfarroba e avaliou-se o seu potencial de manutenção da pluripotência através da análise da morfologia das colónias, do ensaio da fosfatase alcalina, da expressão de marcadores de pluripotência (Nanog, Sox2 e Oct4) e da capacidade de diferenciação nos três folhetos embrionários (endoderme, mesoderme e ectoderme) após cultura a longo prazo. De acordo com os resultados, as células estaminais embrionárias cultivadas em goma de semente de alfarroba apresentaram-se sob a forma de colónias regulares, semelhantes às colónias obtidas quando as células estaminais foram cultivadas em fibroblastos, o suporte standard para a manutenção da pluripotência. As células estaminais embrionárias cultivadas em goma de semente de alfarroba mantiveram a sua viabilidade e tiveram um crescimento semelhante às células cultivadas em gelatina. Por outro lado, as células estaminais embrionárias cultivadas em goma de semente de alfarroba apresentaram níveis de expressão de marcadores de pluripotência e de atividade da fosfatase alcalina equivalentes e em alguns pontos mais elevados do que as células cultivadas em gelatina. Após 30 dias de cultura em goma de semente de alfarroba, as células estaminais embrionárias mantiveram a sua capacidade de se diferenciar nos três folhetos embrionários. Apesar das várias vantagens apresentadas pelos polímeros naturais, a sua composição pode variar consoante o lote e o produtor. O principal componente da goma de semente de alfarroba é o polímero galactomanano que se encontra no endosperma das sementes e funciona como reserva energética. Neste trabalho testou-se também a utilização de goma de semente de alfarroba de diferentes origens (Roeper e Industrial Farense) e purificada versus não purificada, para cultura de células estaminais embrionárias. Em geral, confirmou-se que o revestimento do poliestireno tratado para cultura de células com goma de semente de alfarroba promove o crescimento de células estaminais embrionárias num estado indiferenciado e viável, o que tem potencial para ser um suporte de origem vegetal para cultura de células alternativo à gelatina. Tendo em conta que a matriz extracelular nativa é maioritariamente constituída por fibras, e que no caso da cultura sobre fibroblastos estas são produzidas pelos fibroblastos, desenvolveu-se um suporte de nanofibras poliméricas de poli (etilenoglicol-β-metacrilato de trimetilsilício-β-ácido metacrílico), conjugado com péptido glicina-arginina-glicina-aspartato-serina. Esta matriz é então resultante da conversão de co-polímeros anfifílicos em nanofibras através de um processo de organização espontânea (self-assembly). Considerando que um suporte ideal deve conter locais que proporcionem a adesão celular, os co-polímeros anfifílicos foram desenhados e sintetizados de modo a incorporar uma sequência de péptidos termoestáveis que correspondem a uma sequência biológica integrante da matriz extracelular. Com o objetivo de determinar o potencial de aplicação futura do suporte de nanofibras para cultura de células estaminais, células estaminais embrionárias indiferenciadas de ratinho foram cultivadas no suporte de nanofibras e em condições convencionais. O potencial de aplicação das nanofibras em investigação de células estaminais foi avaliado através da morfologia, proliferação, viabilidade, auto-renovação e pluripotência das células estaminais embrionárias indiferenciadas de ratinho comparativamente com os resultados obtidos para as condições de cultura standard. De acordo com os resultados, as nanofibras promoveram o crescimento celular e um aumento da expressão dos genes de pluripotência em comparação com as metodologias convencionais de cultura de células estaminais. Além disso, as células estaminais embrionárias cultivadas a longo prazo em nanofibras conservaram a capacidade de diferenciação. Portanto, neste trabalho foi desenvolvido uma nova matriz de nanofibras sintéticas que permite a eliminação de matrizes de origem animal e providencia um método económico para cultura de células constituído por uma rede de nanofibras. Esta matriz de nanofibras possui uma escala semelhante à matriz extracelular nativa onde as células podem ser mantidas e manipuladas. Paralelamente ao estudo da utilização de biomateriais na cultura e manutenção de células estaminais, a última parte do meu trabalho foi dedicada ao estudo da função da proteína CCBE1. A proteína CCBE1 contém domínios putativos de colagénio e de fator de crescimento epidermal (EGF). O gene Ccbe1 foi identificado num ensaio de expressão diferencial efetuado para revelar novos genes expressos nos percursores cardíacos realizado pelo nosso laboratório e está envolvido em processos de linfangiogénese, cardiogénese e carcinogénese. No entanto, apesar de putativamente CCBE1 ser uma proteína secretada, a sua função e mecanismo de ação continuam a ser desconhecidos. Dados experimentais publicados e outros realizados no nosso laboratório revelaram que o ratinho mutante para o gene Ccbe1 morre durante o desenvolvimento embrionário. Outros resultados indicam que Ccbe1 é muito expresso em fibroblastos embrionários de ratinho. Por estas razões, foram realizados estudos de função de Ccbe1 utilizando culturas primárias de fibroblastos embrionários de ratinho como modelo. Realizaram-se ensaios de adesão, proliferação, viabilidade e migração. De acordo com os resultados, verificou-se que os fibroblastos isolados do ratinho mutante para Ccbe1 a E13.5 apresentam uma morfologia típica de fibroblastos senescentes, a sua proliferação é mais lenta e têm expressão de Bax aumentada, um inibidor de proliferação celular. Por outro lado, quando CCBE1 é adicionado a fibroblastos Ccbe1-/-, a sua proliferação e viabilidade aumentam. O papel de Ccbe1 em migração foi também testado. Os fibroblastos mutantes para Ccbe1 apresentaram um carácter mais migratório do que os fibroblastos normais e dependente do substrato. Contrariamente, este carácter migratório é reduzido quando o ensaio de migração é feito na presença de CCBE1 no meio de cultura. Apesar de o mecanismo de ação de Ccbe1 continuar a ser desconhecido, os resultados aqui apresentados sugerem que Ccbe1 coordena a adesão celular, migração e proliferação, o que sugere que Ccbe1 deverá desempenhar um papel fundamental na matriz extracelular.