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Browsing FCB1-Teses by Subject "3´UTR"
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- Importância da região 3´UTR do mRNA do deltaC no desenvolvimento de Peixe-ZebraPublication . Tavares, Alene Patrícia Semedo; Andrade, Raquel P.; Campinho, Marco A.A somitogénese é um processo morfogenético altamente regulado e conservado entre os vertebrados. Durante este processo ocorre a formação de sómitos de forma rítmica e sequencial ao longo do eixo ântero-posterior do embrião a partir de um tecido progenitor não segmentado denominado de mesoderme pré-somítica (PSM). Os sómitos são aglomerados de células da mesoderme, precursores do esqueleto e da musculatura axial. A periodicidade da formação de sómitos a partir da PSM é imposta por um oscilador molecular denominado de relógio molecular que leva à expressão cíclica de um conjunto de genes, que se propaga ao longo da PSM no sentido caudo-rostral. A comunicação celular e a sincronização das oscilações de expressão na PSM através da sinalização intercelular Notch-Delta são fundamentais no controlo da somitogénese e da diferenciação celular. Esta oscilação da expressão dos genes do relógio é controlada por um mecanismo de regulação de feedback negativo, onde a instabilidade do mRNA desempenha um papel fundamental. A região 3´UTR geralmente contém vários elementos reguladores que governam a expressão espacial e temporal de diferentes mRNAs. Estudos anteriores do laboratório demostraram uma estabilização do mRNA do gene deltaC de peixe-zebra na ausência de porções da região 3´UTR. Para melhor compreensão do fenótipo, neste trabalho foi avaliado o papel da região 3’UTR do gene deltaC na somitogénese de embriões de peixe-zebra. Para isso foram utilizadas diferentes linhas mutantes em que a região 3'UTR do gene deltaC foi editada usando a tecnologia CRISPR/Cas9. Procedeu-se à caracterização do padrão de expressão dos genes her7 e deltaC e caracterização morfológica dos sómitos formados para perceber o impacto destas alterações. Os resultados do presente estudo confirmaram que a região 3´UTR de deltaC é importante para a correta expressão de deltaC e her7, bem como para a segmentação corporal do embrião de peixe-zebra. Embora nos embriões RR2 e RR3 a segmentação não é interrompida, o número total de sómitos é menor e os sómitos anteriores são ligeiramente mais curtos. Usando uma linha transgénica em que o Notch Intracellular Domain (NICD) é expresso constitutivamente após indução térmica observou-se diminuição do tamanho dos sómitos como nos embriões RR3 o que sugere que o fenótipo observado nos embriões mutantes poderá ser devido a um aumento da sinalização Notch durante a somitogénese.
- Regulating the pace of the embyo clock: RNA molecules in temporal control of vertebrate developmentPublication . Carraco, Gil Daniel Bregieiro; Andrade, Raquel P.Durante as últimas décadas têm-se estudado com profundidade os mecanismos genéticos que levam ao correto desenvolvimento do embrião vertebrado. Estes mecanismos têm sido estudados especialmente na caraterização da expressão genética nos tecidos e de que modo a sua presença ou ausência se reflete na correta diferenciação de uma célula, no desenvolvimento de um tecido ou órgão e na correta formação do organismo. Contudo para além da localização e intensidade da expressão, uma outra dimensão muito menos explorada é o Tempo. A desregulação temporal da expressão génica pode levar a que os tecidos se diferenciem num momento ou ritmo impróprio, podendo ter consequências graves e levar mesmo à morte do organismo. Um dos processos que evidencia uma periodicidade durante o desenvolvimento, é a somitogénese. À medida que o embrião alonga ao longo do eixo antero-posterior graças à ingressão de células no botão caudal, as células da mesoderme pré-somítica (PSM) anterior formam periodicamente pares de estruturas esféricas transitórias que flanqueiam a notocorda, conhecidas como sómitos. Os sómitos diferenciam-se sendo responsáveis pela formação do esqueleto axial, bem como da musculatura esquelética e a derme das costas. A desregulação temporal da somitogénese, provoca doenças congénitas graves que afetam especialmente a formação das vertebras, como a disostose espondilocostal. Existe um relógio embrionário (EC) subjacente à periodicidade da somitogénese. O EC foi primeiramente descrito por Palmeirim e colegas (1997) no desenvolvimento do embrião de galinha. Este grupo descobriu que o gene hairy1 tem ciclos de expressão na PSM com o mesmo período que a somitogénese, 90 minutos. Posteriormente, este mecanismo foi descoberto noutros organismos e hoje em dia, sabe-se que é conservado em todos os vertebrados. O período EC é específico de cada espécie, sendo, por exemplo, 30 minutos no peixe-zebra, 120 no ratinho e entre 5 e 6 horas no Humano. Sabe-se também que vários genes pertencentes a várias vias de sinalização possuem expressão cíclica. Mais concretamente, pertencentes às vias de Notch, FGF e WNT. Dez anos depois da descoberta do EC, foi descrito que este mecanismo não era exclusivo da PSM. Pascoal e colegas (2007) descobriram que o relógio embrionário estava presente no crescimento do membro da galinha. Mais concretamente, o grupo descreveu que o gene hairy2 tem uma expressão cíclica, apresentando um período de seis horas em vez dos 90 minutos na PSM. O EC é caracterizado por mecanismos de regulação por feedback negativo em que um gene é expresso e traduzido e a proteína vai reprimir a sua própria expressão. Para além disso, o mecanismo é refinado por atrasos em diversas etapas, desde a transcrição, passando pela exportação nuclear do mRNA, pela tradução e terminando na degradação do mRNA e da proteína. Contudo, a regulação do EC, mais propriamente, como é capaz de apresentar diferentes períodos no mesmo organismo, ainda permanece por esclarecer, constituindo a questão central do presente trabalho. Neste trabalho foi explorada a hipótese da regulação da periodicidade do EC em diferentes tecidos ser exercida ao nível das moléculas de RNA. Para abordar esta hipótese, foram aplicadas diversas metodologias experimentais. Em primeiro lugar foram identificados os transcritos produzidos por hairy1 e analisado o seu impacto na segmentação do tronco embrionário (Capítulo 2). Para tal, foi feita uma sobre-expressão de ambos os transcritos identificados na PSM do embrião de galinha. Os nossos resultados indicam que a sobreexpressão do s-hairy1, tal como de hairy1, leva a um atraso no alongamento dos embriões, e a um atraso no início da somitogénese. Neste capítulo, adicionalmente, procurámos aprofundar o conhecimento acerca do relógio embrionário no membro. Estudámos a expressão de hairy1, descobrindo que também cicla com um período de 6 horas no mesênquima distal do membro. A região 3’UTR do mRNA é um dos maiores responsáveis pela regulação do tempo de meia-vida do próprio mRNA. Tendo isso em mente, estudámos os 3’UTRs de três genes centrais do relógio embrionário do peixe-zebra, her1, her7 e deltaC (dlc) (Capítulo 3). No caso de her1 e her7 deletou-se 3’UTR alternativos, contudo os resultados obtidos não revelaram um papel para os 3’UTRs alternativos no funcionamento do EC. No caso do gene dlc, dividiuse o 3’UTR em três regiões de regulação (RR), e procedeu-se à deleção dessas regiões isoladamente, ou em combinação. Quando deletadas RR1, RR2 ou a combinação das duas (RR1&2), não foram detetadas alterações significativas à expressão de dlc. Contudo, quando foram removidas RR3 ou RR2&3 obteve-se uma estabilização da expressão dos genes do EC. Uma avaliação mais aprofundada das deleções RR2 e RR3 revelou que os embriões produziam menos sómitos e mais pequenos, resultado mais notório na deleção RR3. Em ambos os casos também se verificou uma estabilização da expressão de her7. Por último, decidiu-se estudar se os miRNAs podem estar envolvidos na regulação dos períodos do EC (Capítulo 4). Para tal, analisou-se o miRNoma por sequenciação de RNA a partir de três tecidos que apresentam oscilações do EC com diferentes ritmos: PSM determinada (D-PSM), PSM indeterminada (U-PSM) e o domínio distal cíclico do membro superior (DCD). Foram identificados 926 miRNAs conhecidos. Para além disso descobrimos mais 1141 possíveis novos miRNAs em galinha (quase duplicando os que se encontram anotados na base de dados miRBase). Procedemos, posteriormente, a uma análise de expressão diferencial e à validação dos dados por RT-qPCR. Adicionalmente, os miRNAs diferencialmente expressos entre os tecidos foram comparados com os genes negativamente regulados nos mesmos tecidos e procedemos a uma análise de enriquecimento funcional GO e REACTOME. Em suma, utilizando uma nossa estratégia plural para testar a nossa hipótese, levounos a um aprofundar do conhecimentos dos mecanismos que controlam a expressão genética periódica nos tecidos onde o EC opera.