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Browsing FCB1-Teses by Subject "Abscission"
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- Definição dos mecanismos de polaridade celular durante a citocinesePublication . Silva, Frederica Gil Figueiredo Leitão; Florindo, Cláudia; Tavares, ÁlvaroA conclusão do processo da citocinese é o evento final da divisão celular. De forma a garantir a estabilidade genética dos organismos a citocinese não pode ocorrer antes que os cromossomas sejam fielmente segregados. Falhas neste processo são uma importante causa de instabilidade genética, ou seja, quando desregulado este processo poderá conduzir a anormalidades em organismos multicelulares, como o cancro. Durante a citocinese há a constrição do anel de actmiosina, seguindo-se a formação da ponte intercelular, na qual no meio se encontra o midbody. Este é constituído por várias proteínas que são necessárias para o início da abscisão (ex: hsMOB4A e hsMOB4B, γ-tubulina, centriolina, etc). Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que as proteínas hsMOB4A e hsMOB4B são essenciais para a execução da abscisão e que quando depletadas aumentam a mobilidade celular. Muitas proteínas que se localizam no midbody, encontram-se também noutras estruturas (ex: centrossomas). Esta diversidade de localizações e funções, torna a dissecação do mecanismo citocinético complicado, sendo de difícil análise a função de cada proteína associada a uma localização celular, apenas através da técnica de RNAi. Uma técnica que permite a inactivação temporal e local é a Chromophore Assited Laser Inactivation (CALI). A base desta técnica é a inactivação local da proteína de interesse devido a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) após a iluminação com um laser. Neste trabalho, foram desenvolvidas ferramentas para a realização de ensaios de CALI. Criaram-se linhas estáveis a expressar β-tubulina-SNAP-tag e γ-tubulina-SNAP-tag para otimização dos ensaios de CALI e, também, para analisar qual a função destas proteínas na abscisão. Para ensaios de CALI em conjunto com a técnica de RNAi (para deplecção da hsMOB4A e hsMOB4B endógenas) nas proteínas hsMOB4A e hsMOB4B, foram concebidos e caracterizados clones hsMOB4A e hsMOB4B resistentes ao RNAi, com o objectivo da geração de duas linhas estáveis, SNAP-tag-hsMOB4A e SNAP-tag-hsMOB4B resistentes ao RNAi, de modo a perceber qual a localização necessária destas proteínas para que ocorra o processo de abscisão. Todas estas ferramentas desenvolvidas ao longo deste trabalho, permitirão realizar ensaios de CALI nas proteínas de interesse e compreender qual a sua localização para que ocorra o evento final da citocinese, a abscisão.