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- Generating asymmetries in the early vertebrate embryo: the role of the Cerberus-like familyPublication . Belo, José A.; Silva, Ana C.; Borges, Ana; Filipe, Mário; Bento, Margaret; Gonçalves, Lisa; Vitorino, Marta; Salgueiro, Ana Marisa; Texeira, Vera; Tavares, Ana T.; Marques, SaraOne fundamental aspect of vertebrate embryonic development is the formation of the body plan. For this process, asymmetries have to be generated during early stages of development along the three main body axes: Anterior-Posterior, Dorso-Ventral and Left-Right. We have been studying the role of a novel class of molecules,the Cerberus/Dan gene family. These are dedicated secreted antagonists of three major signaling pathways: Nodal, BMP and Wnt. Our studies contribute to the current view that the fine tuning of signaling is controlled by a set of inhibitory molecules rather than by activators. In this context, the Cerberus-like molecules emerge as key players in the regulation and generation of asymmetries in the early vertebrate embryo.
- Functional study of genes expressed in the AVE during mouse embryonic development: introducing the novel gene MAd4Publication . Salgueiro, Ana Marisa; Belo, José AntónioA presente dissertação insere-se no âmbito do estudo do desenvolvimento embrionário, uma área de crescente interesse que integra biologia molecular e celular, genética, fisiologia, neurobiologia e imunologia. O modelo animal escolhido para estes estudos foi o ratinho (mus musculus). Entre Humano e ratinho existe uma conservação evolucionária que se reflecte ao nível do genoma, partilhando entre eles 99% da sequência de ADN e uma organização idêntica dos cromossomas, assim como a natureza dos genes codificados. Recentemente, grandes avanços tecnológicos tornaram possível a manipulação do genoma de ratinho em células estaminais embrionárias, e a construção de linhas mutantes de genes de interesse com fenótipos relevantes servem de base ao estudo da biologia dos mamíferos e à compreensão dos mecanismos de doenças. Este conhecimento pretende-se que seja aplicado no desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico de terapia. Nesta era pós-genómica, em que foi tornado publico sequências genómicas, tem sido possível interpretar os mais diversos acontecimentos celulares em termos de regulação genética. No que diz respeito ao conhecimento sobre o desenvolvimento embrionário de ratinho, vários estudo genéticos levaram à identificação de vias de sinalização essenciais para o controlo de crescimento celular e diferenciação do embrião, desde a formação do blastocisto, durante a gastrulação e organogénese. Em particular, o estudo da formação dos eixos embrionários tem sido um dos grandes desafios na área da biologia do desenvolvimento. O corpo de um vertebrado constrói-se em torno dos eixos Anterior-Posterior (A-P), Dorso-Ventral (D-V) e Esquerdo-Direito (E-D), um processo que depende da regulação de transcrição genética e sinalização intercelular, quer ao nível temporal como espacial. Várias experiências realizadas em vertebrados inferiores levaram à identificação de vários factores de transcrição e estruturas essenciais no desenvolvimento embrionário. Contudo, existe uma relevância relativa da função destes genes e estruturas quando comparados em termos evolutivos. Ainda assim, é possível identificar alguns mecanismos fundamentais de regulação genética da diferenciação celular e definição dos eixos embrionários, conservados entre espécies. São exemplo, as vias de sinalização de WNT, TGF-β (Transforming Growth Factor β) e FGF (Fibroblast Growth Factor). No embrião de ratinho identificou-se a Endoderme Visceral como uma estrutura fundamental para a organização do epiblasto. Trata-se de um tecido extra-embrionário que regula a actividade de factores de crescimento da família dos TGFβ, tais como os BMPs (Bone Morphognetic Protein) e Nodal, assim com as vias de sinalização dos WNT, gerando um gradiente de expressão genética ao longo do embrião. Actualmente, considera-se que este padrão de assimetria genética é a base para a definição dos eixos embrionários. Em particular, no que diz respeito à formação do eixo A-P, a Endoderme Visceral Anterior (EVA) tem sido indicada como um centro organizador das estruturas anteriores no embrião de ratinho. A EVA é uma população de células da endoderme visceral que apresenta uma morfologia distinta, localizada na região distal do embrião com 5.5 dias de desenvolvimento, e que tem a capacidade se movimentar, migrando e demarcando a futura região anterior do embrião aquando do início da gastrulação. Na EVA são expressos vários genes tais como cerl-1, lefty1, Hex, goosecoid, otx2, Hesx1, lim1, dkk1, produzindo antagonistas das vias de sinalização de WNT, Nodal e BMP. O primeiro estudo realizado com Cerberus, em Xenopus, demonstrou que esta proteína tem a capacidade de inibir a actividade dos ligandos Nodal, BMP4 e Wnt, permitindo, assim, a formação de cabeça e estruturas anteriores. O homólogo de Cerberus em ratinho, cerberuslike1, é expresso na EVA, mas a sua função ainda não foi determinada. Ratinhos mutantes homozigóticos do gene cerl1 não apresentam qualquer fenótipo: são viáveis e animais férteis sem qualquer alteração no que diz respeito a organização de estruturas anteriores ou qualquer outro órgão/estrutura ao longo de todo o organismo. No entanto, estudos posteriores demonstram que Cerl1 actua em cooperação com Lefty, proteínas também conhecidos pelo seu carácter antagonista em relação a Nodal. A expressão de Cer1 e Lefty1 na EVA inibe a via de sinalização de Nodal no epiblasto, limitando a acção de Nodal à zona posterior do embrião. Com o intuito de aprofundar o conhecimento da via de sinalização Nodal, e uma vez que esta é extremamente importante durante o desenvolvimento embrionário, efectuou-se um estudo desenhado para avaliar potenciais interacções entre Cerl1 e Cripto. Cripto é expresso no epiblasto, durante o desenvolvimento embrionário de ratinho, está envolvido na definição do eixo A-P e na formação da mesoderme, e tem sido indicado com um co-receptor necessário para a transdução de sinais Nodal. A experiência consistiu na remoção em simultâneo do antagonista Cer1 e do co-receptor Cripto, através de cruzamentos de linhas mutantes de ratinhos. A análise dos embriões duplo mutante Cer1;Cripto mostrou que é possível recuperar parcialmente do fenótipo observado no embriões Cripto-/-, nomeadamente a orientação do eixo A-P, a formação de mesoderme e neuroectoderm. Estes resultados indicam que a determinação do eixo A-P é regulada pela via de sinalização Nodal, no entanto trata-se de um mecanismo independente do co-receptor Cripto. Uma vez que ao longo destes anos a Endoderme Visceral Anterior tem sido apontada como uma das estruturas embrionárias envolvidas na organização dos eixos, foi realizado um rastreio diferencial a afim de identificar os genes que são expressos, preferencial e/ou exclusivamente, nesta região. Recorrendo a uma linha de ratinhos transgénica na qual a proteína EGFP é expressa sobre a acção do promotor de Cerl-1, foi possível acompanhar visualmente a migração das células da endoderme visceral, desde a extremidade distal até à posição da futura região anterior do embrião. Uma vez determinadas as regiões anterior-distal (Ad) e posterior-proximal (Pp), sendo esta diametralmente oposta à primeira, dos embriões transgénicos no estádio de desenvolvimento E5.5, procedeu-se à micro-dissecação da endoderme visceral e consequentemente da porção de epiblasto associada a esta. Ambas as amostras, Ad e Pp, foram analisadas através da hibridação de mRNA em Affymetrix GeneChip ®. Como resultado, obtemos uma lista de genes que apresentam uma expressão diferencial na endoderme visceral anterior. Dentro deste grupo foi possível encontrar uma sobre expressão de lefty1, cer1, gsc, hesx1, lhx (lim1), foxa2 (hnf3β) e otx2, genes que têm sido estudados e já foram identificados com pertencentes exclusivamente à região anterior-distal e que, por sua vez, valida qualquer novo resultado obtido com esta experiência. Atendendo ao principal objectivo de caracterizar e compreender melhor o papel da endoderme visceral anterior durante o desenvolvimento embrionário de ratinho, prosseguiu-se com o estudo de 3 novos genes identificados no rastreio realizado: Adtk1, e os genes GalNAc4S- 6ST e MAd4 dos quais fui a principal responsável pela condução dos trabalhos de investigação aqui reportados. N-Acetilgalactosamina 4-sulfato 6-O-Sulfotransferase (GalNAc4S-6ST) é um enzima que participa na síntese da unidade GlcAβ1-3-GalNAc(4,6-bisSO4) do sulfato de condroitina E (CS-E). O CS-E é um proteoglicano, um tipo de proteínas abundantes na matriz extracelular, conhecidos pela capacidade de se ligar a uma variedade de factores de crescimento incluindo membros da família de TGFβ, Wnt, e FGF, necessários na diferenciação celular e morfogénese do embrião de ratinho. O padrão de expressão GalNAc4S-6ST gene durante o desenvolvimento embrionário mostra que este gene é inicialmente expresso na endoderme visceral anterior, passando gradualmente a marcar a endoderme definitiva, na porção mais anterior do embrião. Ao longo do desenvolvimento, GalNAc4S-6ST é expresso na mesoderme e endoderme do futuro tubo intestinal, no ante-cérebro, e nos arcos branqueais. Recentes dados, revelaram que no estádio de desenvolvimento E 14.5, este gene encontra-se activo em várias regiões do cérebro, sistema nervoso central e periférico, assim como no sistema urogenital. É ainda de salientar que GalNAc4S-6ST foi identificado como um genes activados pela via de sinalização Nodal/Activin, o que pode indicar uma possível função na transmissão do sinal de Nodal durante o desenvolvimento embrionário. No entanto, a análise do mutante homozogótico de GalNAc4S-6ST, mostrou no entanto que este gene não é fundamental para desenvolvimento embrionário. Os animais são viáveis e não apresentam fenótipos muito severos, apenas uma alteração na composição morfológica dos ossos, quando comparado com o WT. O presente trabalho serve também para apresentar um novo gene, provisoriamente designado de MAd4 – Mouse Anterior-distal #4. Trata-se de um gene que codifica uma proteína de 99 aminoácidos com domínio transmembranar, pertencente a uma família conservada entre C. elegans, Drosophila melanogaster, zebrafish, Xenopus leavis, ratinho e humano. No entanto a sua função biológica, molecular e celular é desconhecida. A análise do padrão de expressão de MAd4 mostra que este gene é regulado a nível espacial e temporal, sendo expresso em diferentes estruturas e em diferentes etapas do desenvolvimento embrionário. O gene MAd4 começa por ser expresso na EVA e na endoderme definitiva localizada na região mais anterior do embrião. Encontra-se expresso na endoderme do futuro tubo digestivo, na neuroectoderm, na notocorda e no nó. Durante a organogénese, MAd4 está activo no fígado, na espinalmedula, na retina, no telencefalo e metaencefalo. Em diferentes etapas do desenvolvimento embrionário a expressão de MAd4 sobrepõe-se à expressão de, por exemplo, Dkk1 e Sox17 na endoderme visceral, Hnf3-β e Gata4 na endoderme do tubo intestinal, e Nog e Chrd na notocorda. A função de MAd4 continua ainda por determinar, no entanto Células Estaminais Embrionárias foram manipuladas afim de produzir um ratinho mutante, e com este modelo animal proceder ao estudo da perda de função. Os dois novos genes apresentados neste trabalho – GalNAc4S-6ST e Mad4 – fazem parte dum complexo conjunto de moléculas encontradas na Endoderme Visceral Anterior, uma estrutura necessária ao desenvolvimento embrionária de ratinho. A função específica destes novos genes na EVA continua por se determinar, no entanto os resultados obtidos mostram que são genes com uma expressão genética regulada ao nível espacial e temporal, participando activamente na formação de várias estruturas do embrião. Contudo, esta nova informação vem contribuir para a análise do genoma de ratinho e melhor compreensão dos mecanismos biológicos do desenvolvimento embrionário.
- N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O-sulfotransferase expression during early mouse embryonic developmentPublication . Salgueiro, Ana Marisa; Filipe, Mario; Belo, José A.N-acetylgalactosamine 4-sulfate 6-O-sulfotransferase (GalNAc4S-6ST) is an enzyme which is known to help build up the GlcA beta 1-3GalNAc(4,6-bisSO(4)) unit of chondroitin sulfate E (CSE). This enzymatic activity has been reported in squid cartilage and in human serum, but has never been reported as an enzyme required during early mouse development. On the other hand, CSE has been shown to bind with strong affinity to Midkine (MK). The latter is a heparin-binding growth factor which has been found to play important regulatory roles in differentiation and morphogenesis during mouse embryonic development. We have analyzed the expression pattern of the GalNAc4S-6ST gene during early mouse embryonic development by whole mount in situ hybridization. The results show that GalNAc4S-6ST is differentially expressed in the anterior visceral ectoderm at stage E5.5 and later becomes restricted to the embryonic endoderm, especially in the prospective midgut region. During the turning process, expression of GalNAc4S-6ST gene is detected in the forebrain, branchial arches, across the gut tube (hindgut, midgut and foregut diverticulum), in the vitelline veins and artery and in the splanchnopleure layer. These results open the possibility of a role for GalNAc4S-6ST during early mouse development.
- A secreted BMP antagonist, Cer1, fine tunes the spatial organization of the ureteric bud tree during mouse kidney developmentPublication . Chi, Lijun; Saarela, Ulla; Railo, Antti; Prunskaite-Hyyrylainen, Renata; Skovorodkin, Ilya; Anthony, Shelagh; Katsu, Kenjiro; Liu, Yu; Shan, Jingdong; Salgueiro, Ana Marisa; Belo, Jose Antonio; Davies, Jamie; Yokouchi, Yuji; Vainio, Seppo J.The epithelial ureteric bud is critical for mammalian kidney development as it generates the ureter and the collecting duct system that induces nephrogenesis in dicrete locations in the kidney mesenchyme during its emergence. We show that a secreted Bmp antagonist Cerberus homologue (Cer1) fine tunes the organization of the ureteric tree during organogenesis in the mouse embryo. Both enhanced ureteric expression of Cer1 and Cer1 knock out enlarge kidney size, and these changes are associated with an altered three-dimensional structure of the ureteric tree as revealed by optical projection tomography. Enhanced Cer1 expression changes the ureteric bud branching programme so that more trifid and lateral branches rather than bifid ones develop, as seen in time-lapse organ culture. These changes may be the reasons for the modified spatial arrangement of the ureteric tree in the kidneys of Cer1+ embryos. Cer1 gain of function is associated with moderately elevated expression of Gdnf and Wnt11, which is also induced in the case of Cer1 deficiency, where Bmp4 expression is reduced, indicating the dependence of Bmp expression on Cer1. Cer1 binds at least Bmp2/4 and antagonizes Bmp signalling in cell culture. In line with this, supplementation of Bmp4 restored the ureteric bud tip number, which was reduced by Cer1+ to bring it closer to the normal, consistent with models suggesting that Bmp signalling inhibits ureteric bud development. Genetic reduction of Wnt11 inhibited the Cer1-stimulated kidney development, but Cer1 did not influence Wnt11 signalling in cell culture, although it did inhibit the Wnt3a-induced canonical Top Flash reporter to some extent. We conclude that Cer1 fine tunes the spatial organization of the ureteric tree by coordinating the activities of the growth-promoting ureteric bud signals Gndf and Wnt11 via Bmp-mediated antagonism and to some degree via the canonical Wnt signalling involved in branching.
- Identification and functional analysis of novel genes expressed in the Anterior Visceral EndodermPublication . Gonçalves Dias Da Silva, Lisa; Filipe, Mario; Marques, Sara; Salgueiro, Ana Marisa; Becker, Jorg D.; Belo, José A.During early vertebrate development, the correct establishment of the body axes is critical. The anterior pole of the mouse embryo is established when Distal Visceral Endoderm (DVE) cells migrate to form the Anterior Visceral Endoderm (AVE). Symmetrical expression of Lefty1, Cer1 and Dkk1 determines the direction of DVE migration and the future anterior side. In addition to the establishment of the Anterior-Posterior axis, the AVE has also been implicated in anterior neural specification. To better understand the role of the AVE in these processes, we have performed a differential screening using Affymetrix GeneChip technology with AVE cells isolated from cer1P-EGFP transgenic mouse embryos. We found 175 genes which were upregulated in the AVE and 36 genes in the Proximal-posterior sample. Using DAVID software, we characterized the AVE cell population regarding cellular component, molecular function and biological processes. Among the genes that were found to be upregulated in the AVE, several novel genes were identified. Four of these transcripts displaying high-fold change in the AVE were further characterized by in situ hybridization in early stages of development in order to validate the screening. From those four selected genes, one, denominated Adtk1, was chosen to be functionally characterized by targeted inactivation in ES cells. Adtk1 encodes for a serine/threonine kinase. Adtk1 null mutants are smaller and present short limbs due to decreased mineralization, suggesting a potential role in chondrogenesis during limb development. Taken together, these data point to the importance of reporting novel genes present in the AVE.