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Publication
Study of BUB1 functions in the neurodevelopment
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Abstract(s)
Budding uninhibited by benzimidazole 1 (BUB1) is a kinase protein essential for proper chromosome segregation. Recently, we identified two biallelic BUB1 mutations linked to primary microcephaly, a rare condition causing reduced head size. The transmission pattern of BUB1’s individuals was consistent with the Autosomal Recessive Primary Microcephaly 30 (MCPH30).
The present thesis aimed to understand how the BUB1 protein functions during human neurodevelopment, and how, when affected, it leads to microcephaly. We successfully generated a new induced pluripotent stem cells (iPSCs) line from patient 2’s fibroblasts. Two clones - clone 4 (C4) and clone 7 (C7) - were characterised by standard norms. Both showed pluripotency and the ability to differentiate in cells from all germ layers. However, while C4 had a diploid karyotype, C7 held trisomy on chromosome 8. To evaluate BUB1’s role in neurodevelopment, wild-type iPSCs were differentiated in neuro progenitor cells (NPCs) and then submitted to differentiation and maturation steps. Our findings reveal that when NPCs were treated with the BUB1 inhibitor drug, BAY1816032, they could not eliminate the signal for the main substrate of the BUB1 kinase, the phosphorylation on H2A-T120 (pH2A-T120), as demonstrated in somatic cells. However, pH2A-T120 levels on forebrain cells were sensible to BAY1816032. These cells hold several morphological modifications. In addition, diploid C4 iPSCs were differentiated into NPCs. However, C4-NPCs exhibited poor stability under multipotent conditions. Additionally, C4-forebrain cells also displayed morphological changes. Previous lab results showed that BAY1816032-treatment induced microcephaly in chicken embryos. However, our preliminary study revealed that microcephalic size depends on the developmental stage.
This project successfully developed a new cell line for studying BUB1, made available to the community (Ferreira et al., 2024). And, despite preliminary, our overall results support BUB1's crucial role in NPCs maintenance and proper forebrain neurodevelopment.
As células passam por um processo denominado ciclo celular para se multiplicarem, isto é, para que se possam dividir em duas células semelhantes, ou para se diferenciarem, ou seja, gerarem duas células específicas para cada tecido, as quais podem ser iguais ou não. O ciclo celular é subdividido em fases, a passagem e o progresso entre estas é verificado por maquinaria molecular específica de modo a garantir a correta divisão dos cromossomas. Na presença de um incorreto alinhamento destes, é ativo o SAC, do inglês Spindle Assembly Checkpoint. A cináse Budding uninhibited by benzimidazole 1 (BUB1) foi descoberta e primeiramente associada a funções do SAC. Mutações bi-alélicas do gene BUB1 foram identificadas em dois indivíduos com microcefalia primária, entre outras características. Microcefalia é uma condição congénita caracterizada por uma redução do tamanho da cabeça face ao controlo. Embora as funções do BUB1 durante o ciclo celular têm vindo a ser muito estudadas, não há literatura publicada sob as suas funções no contexto neuronal e qual a relação com a microcefalia. Esta tese teve como principal objetivo estudar o papel da BUB1 durante o neuro-desenvolvimento humano e como a sua disfunção está relacionada com microcefalia. Considerando que o mesmo nunca foi analisado previamente no laboratório, o nosso primeiro passo foi gerar novos modelos de estudo. Para isso, gerámos com sucesso uma nova linha de células estaminais pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos da pele do paciente número 2, utilizando fatores estabelecidos como essenciais para a pluripotência durante a sua reprogramação (fatores Yamanaka). Dois clones – clone 4 (C4) e clone 7 (C7) – foram caracterizados segundo as normas estabelecidas pela Sociedade Internacional para a Investigação em Células Estaminais: quanto à sua pluripotência, a sua capacidade de gerar células das três camadas germinativas e ainda o seu cariótipo de modo a verificar que a reprogramação não alterou número de cromossomas. Ambos os clones demonstraram pluripotência e capacidade de diferenciação em células da endoderme, mesoderme e ectoderme. Relativamente ao cariótipo, o C4 apresentou um cariótipo diploide, ou seja, um número normal de cromossomas, enquanto todas as células do C7 revelaram-se aneuploides, com uma cópia extra do cromossoma 8. Esta linha pode no futuro ser utilizada para estudar este tipo de trissomia, e a sua dependência no BUB1. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo avaliar o papel de BUB1 durante o neuro-desenvolvimento. Para isso, células estaminais pluripotentes induzidas de um indivíduo controlo foram diferenciadas em células progenitoras neuronais e submetidas a processos de diferenciação e maturação, otimizando o protocolo. Estas células foram tratadas com um composto que inibe a atividade cináse de BUB1 (BAY1816032), durante diferentes fases do processo. Sabe-se que o tratamento de células somáticas, fibroblastos, com BAY1816032 impede o processo de fosforilação na treonina 120 na histona H2A (pH2A-T120) pela proteína BUB1. Porém, em condições de multipotência, células progenitoras neuronais tratadas com BAY1816032 mantiveram alguma fosforilação, cerca de 20%. Este resultado sugere que nas células progenitoras neuronais esta fosforilação pode não ser provocada apenas pela proteína BUB1, ou que, estas células não são tão sensíveis como as células somáticas. No entanto, células do prosencéfalo (células progenitoras neuronais diferenciadas e maturadas) mostraram-se sensíveis ao tratamento com BAY1816032, não apresentando sinais de pH2A-T120 e sofrendo diversas alterações morfológicas. Para caracterizar a população neuronal, utilizamos dois marcadores, um para neurónios (TUJ1) e outro para astrócitos (GFAP). Foi nos possível observar que em ambas as populações existiam células com diferentes níveis de pH2A-T120. Após quatro semanas de maturação, as células neuronais que apresentavam altos níveis de fosforilação, ao serem tratadas com BAY1816032, passaram a evidenciar pH2A-T120 a níveis residuais. Indicando que, consoante o estadio da diferenciação neuronal, BUB1 apresenta diferentes sensibilidades, sendo bastante mais sensível durante a fase da maturação que na fase de multipotência; este resultado sugere também que esta fosforilação é totalmente dependente de BUB1 nestas células. Quando BAY1816032 foi adicionado durante um longo período (10 dias) durante a maturação, a população neuronal apresentou mudanças evidentes tais como: uma maior quantidade de mais curtas ramificações e uma maior taxa de morte celular, que a condição controlo (em DMSO). Depois de otimizado, este protocolo foi aplicado nas células estaminais pluripotentes induzidas geradas do paciente 2 (C4), a fim de analisar como é que a anormal atividade cinase de BUB1, causada pelas mutações bialélicas, influencia o processo de diferenciação neuronal. Estas células foram igualmente induzidas a células progenitoras neuronais, que por sua vez demonstraram uma fraca estabilidade em condições de multipotência e uma diferenciação precoce comparando com as células controlo. Ao encontro do resultado anterior, células controlo tratadas com BAY1816032, as células do prosencéfalo derivadas de C4 também exibiram alterações morfológicas, apresentando mais agregados celulares e uma menor percentagem de neurónios maturos, sugerindo um aumento de células da glia, como astrócitos. Ao analisar preliminarmente os níveis de expressão de marcadores neuronais e gliais, verificou-se que os resultados foram concordantes entre si, indicando que as células neuronais derivadas do C4 apresentavam um aumento da expressão do principal marcador de astrócitos, GFAP, em comparação com células controlo. A terceira parte deste trabalho consistiu em usar o mesmo inibidor, BAY1816032, em embriões de galinhas durante o seu desenvolvimento neuronal. Resultados anteriores do laboratório demonstraram que a injeção de BAY1816032 no tubo neural após 51 horas de incubação induziu microcefalia em embriões de galinha nos estadios HH18/HH19. Neste trabalho conduzimos o mesmo protocolo, mas analisamos os estadios HH16/HH17, no qual se concluiu que não havia diferença. Isto sugere que a severidade da microcefalia depende do estadio de desenvolvimento. Esta observação vai ao encontro do resultado obtido anteriormente quando o inibidor foi utilizado em diferentes fazes de diferenciação neuronal de células controlo (em que células maduras são mais sensíveis a BAY1816032 que células multipotentes). Em sumário, este projeto permitiu o desenvolvimento de uma nova linha celular para o estudo de BUB1, disponibilizada à comunidade científica (Ferreira et al., 2024), e que, apesar de preliminares, os nossos resultados apoiam a hipótese de que o BUB1 desempenha um papel crucial na manutenção das células progenitoras neuronais e num adequado neuro desenvolvimento do prosencéfalo.
As células passam por um processo denominado ciclo celular para se multiplicarem, isto é, para que se possam dividir em duas células semelhantes, ou para se diferenciarem, ou seja, gerarem duas células específicas para cada tecido, as quais podem ser iguais ou não. O ciclo celular é subdividido em fases, a passagem e o progresso entre estas é verificado por maquinaria molecular específica de modo a garantir a correta divisão dos cromossomas. Na presença de um incorreto alinhamento destes, é ativo o SAC, do inglês Spindle Assembly Checkpoint. A cináse Budding uninhibited by benzimidazole 1 (BUB1) foi descoberta e primeiramente associada a funções do SAC. Mutações bi-alélicas do gene BUB1 foram identificadas em dois indivíduos com microcefalia primária, entre outras características. Microcefalia é uma condição congénita caracterizada por uma redução do tamanho da cabeça face ao controlo. Embora as funções do BUB1 durante o ciclo celular têm vindo a ser muito estudadas, não há literatura publicada sob as suas funções no contexto neuronal e qual a relação com a microcefalia. Esta tese teve como principal objetivo estudar o papel da BUB1 durante o neuro-desenvolvimento humano e como a sua disfunção está relacionada com microcefalia. Considerando que o mesmo nunca foi analisado previamente no laboratório, o nosso primeiro passo foi gerar novos modelos de estudo. Para isso, gerámos com sucesso uma nova linha de células estaminais pluripotentes induzidas a partir de fibroblastos da pele do paciente número 2, utilizando fatores estabelecidos como essenciais para a pluripotência durante a sua reprogramação (fatores Yamanaka). Dois clones – clone 4 (C4) e clone 7 (C7) – foram caracterizados segundo as normas estabelecidas pela Sociedade Internacional para a Investigação em Células Estaminais: quanto à sua pluripotência, a sua capacidade de gerar células das três camadas germinativas e ainda o seu cariótipo de modo a verificar que a reprogramação não alterou número de cromossomas. Ambos os clones demonstraram pluripotência e capacidade de diferenciação em células da endoderme, mesoderme e ectoderme. Relativamente ao cariótipo, o C4 apresentou um cariótipo diploide, ou seja, um número normal de cromossomas, enquanto todas as células do C7 revelaram-se aneuploides, com uma cópia extra do cromossoma 8. Esta linha pode no futuro ser utilizada para estudar este tipo de trissomia, e a sua dependência no BUB1. A segunda parte deste trabalho teve como objetivo avaliar o papel de BUB1 durante o neuro-desenvolvimento. Para isso, células estaminais pluripotentes induzidas de um indivíduo controlo foram diferenciadas em células progenitoras neuronais e submetidas a processos de diferenciação e maturação, otimizando o protocolo. Estas células foram tratadas com um composto que inibe a atividade cináse de BUB1 (BAY1816032), durante diferentes fases do processo. Sabe-se que o tratamento de células somáticas, fibroblastos, com BAY1816032 impede o processo de fosforilação na treonina 120 na histona H2A (pH2A-T120) pela proteína BUB1. Porém, em condições de multipotência, células progenitoras neuronais tratadas com BAY1816032 mantiveram alguma fosforilação, cerca de 20%. Este resultado sugere que nas células progenitoras neuronais esta fosforilação pode não ser provocada apenas pela proteína BUB1, ou que, estas células não são tão sensíveis como as células somáticas. No entanto, células do prosencéfalo (células progenitoras neuronais diferenciadas e maturadas) mostraram-se sensíveis ao tratamento com BAY1816032, não apresentando sinais de pH2A-T120 e sofrendo diversas alterações morfológicas. Para caracterizar a população neuronal, utilizamos dois marcadores, um para neurónios (TUJ1) e outro para astrócitos (GFAP). Foi nos possível observar que em ambas as populações existiam células com diferentes níveis de pH2A-T120. Após quatro semanas de maturação, as células neuronais que apresentavam altos níveis de fosforilação, ao serem tratadas com BAY1816032, passaram a evidenciar pH2A-T120 a níveis residuais. Indicando que, consoante o estadio da diferenciação neuronal, BUB1 apresenta diferentes sensibilidades, sendo bastante mais sensível durante a fase da maturação que na fase de multipotência; este resultado sugere também que esta fosforilação é totalmente dependente de BUB1 nestas células. Quando BAY1816032 foi adicionado durante um longo período (10 dias) durante a maturação, a população neuronal apresentou mudanças evidentes tais como: uma maior quantidade de mais curtas ramificações e uma maior taxa de morte celular, que a condição controlo (em DMSO). Depois de otimizado, este protocolo foi aplicado nas células estaminais pluripotentes induzidas geradas do paciente 2 (C4), a fim de analisar como é que a anormal atividade cinase de BUB1, causada pelas mutações bialélicas, influencia o processo de diferenciação neuronal. Estas células foram igualmente induzidas a células progenitoras neuronais, que por sua vez demonstraram uma fraca estabilidade em condições de multipotência e uma diferenciação precoce comparando com as células controlo. Ao encontro do resultado anterior, células controlo tratadas com BAY1816032, as células do prosencéfalo derivadas de C4 também exibiram alterações morfológicas, apresentando mais agregados celulares e uma menor percentagem de neurónios maturos, sugerindo um aumento de células da glia, como astrócitos. Ao analisar preliminarmente os níveis de expressão de marcadores neuronais e gliais, verificou-se que os resultados foram concordantes entre si, indicando que as células neuronais derivadas do C4 apresentavam um aumento da expressão do principal marcador de astrócitos, GFAP, em comparação com células controlo. A terceira parte deste trabalho consistiu em usar o mesmo inibidor, BAY1816032, em embriões de galinhas durante o seu desenvolvimento neuronal. Resultados anteriores do laboratório demonstraram que a injeção de BAY1816032 no tubo neural após 51 horas de incubação induziu microcefalia em embriões de galinha nos estadios HH18/HH19. Neste trabalho conduzimos o mesmo protocolo, mas analisamos os estadios HH16/HH17, no qual se concluiu que não havia diferença. Isto sugere que a severidade da microcefalia depende do estadio de desenvolvimento. Esta observação vai ao encontro do resultado obtido anteriormente quando o inibidor foi utilizado em diferentes fazes de diferenciação neuronal de células controlo (em que células maduras são mais sensíveis a BAY1816032 que células multipotentes). Em sumário, este projeto permitiu o desenvolvimento de uma nova linha celular para o estudo de BUB1, disponibilizada à comunidade científica (Ferreira et al., 2024), e que, apesar de preliminares, os nossos resultados apoiam a hipótese de que o BUB1 desempenha um papel crucial na manutenção das células progenitoras neuronais e num adequado neuro desenvolvimento do prosencéfalo.
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Keywords
BUB1 Microcefalia MCPH30 Células pluripotentes induzidas Células progenitoras neuronais Neurónios Bay1816032