Validation of alternative methods in a microbiological laboratory

Pastor, Lucía García

http://hdl.handle.net/10400.1/10497

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Validation of alternative methods in a microbiological laboratory.pdf		2.1 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Pastor, Lucía García

Advisor(s)

Dionísio, Lídia Adelina Pó Catalão

Abstract(s)

Os resultados analíticos gerados por laboratórios devem ser baseados em procedimentos padronizados e relatados o mais rápido possível, de forma a atender às necessidades do cliente. Garantia da Qualidade é um conceito definido pela ISO como todas as ações planeadas e sistemáticas necessárias para gerar confiança de que um produto ou serviço irá satisfazer determinados requisitos de qualidade. A Garantia da Qualidade garante a consistência dos resultados fornecidos pelo laboratório de uma ampla variedade de ações. O Controle de Qualidade, de acordo com a norma ISO, representa o conjunto de técnicas e atividades operacionais que são utilizadas para satisfazer as exigências de qualidade. O Controle de Qualidade pode ser dividido em Controle de Qualidade Externo e Controle Interno de Qualidade. Validação do método é um controle interno de qualidade utilizado para confirmar que o procedimento analítico utilizado para um teste específico é adequado para o uso pretendido. Os resultados da validação do método podem ser usados para avaliar a qualidade, fiabilidade e consistência dos dados analíticos. As cartas de controle são um instrumento vital para o controle interno de qualidade de um processo específico de análise. Permitem compreender se o processo analítico está sob controle estatístico. Em microbiologia, não é simples de explicar quando um método está dentro ou fora de controle, portanto, a sua aplicação em microbiologia deve ser simplesmente orientativa sobre a prática analítica. Sempre que se pretenda usar um novo método ou fazer alterações ao método original é feita uma comparação entre ambos os métodos. ISO 17994:2004 é um guia para a comparação de métodos microbiológicos em aguas.O material de referência é outra parte essencial da garantia da qualidade . Desempenha um papel fundamental na avaliação da consistência dos resultados analíticos no controle de qualidade. Os métodos microbiológicos são comumente classificados em métodos clássicos, enzimáticos e moleculares. Os métodos clássicos utilizados para contagens microbiológicas incluem a Técnica da Fermentação em Tubos Múltiplos e a Técnica da Filtração por Membrana. Estes métodos são reconhecidos, pela ISO, como o método de referência para controle de qualidade microbiológica. A aplicação destes métodos padronizados, que são geralmente rentáveis em consumíveis, não exige nenhuma infra-estrutura especial. No entanto são difíceis de realizar por exigirem grandes volumes de meios e reagentes, os seus procedimentos e obtenção de resultados serem demorados. Conseqüentemente, há um crescente interesse na aplicação de métodos alternativos. Os métodos enzimáticos são baseados na tecnologia do substrato definido. Estes meios contêm substratos enzimáticos ligados a um cromogénio, fluorogénios ou uma combinação de ambos. Métodos moleculares como PCR, qPCR, NASBA, Microarrays ou imunológicos são alguns dos métodos alternativos disponíveis no mercado. Estes métodos permitem-nos obter resultados num espaço de tempo mais curto, e os seus procedimentos são rápidos e de fácil aplicação. Água e alimentos são duas matrizes diferentes, entre outras, tais como sedimentos e ar, que normalmente são analisadas a fim de garantir a protecção da saúde pública e ambiental. O objetivo deste estudo foi (1) implementar e validar, no laboratorio, um método padrão alternativo não enzimático, Colilert-18 ® para a enumeração de coliformes totais e Escherichia coli em amostras de água, em consonância com o Sistema da Qualidade e ISO 17025:2005. Para esse efeito, foi utilizado material de referência ATCC. (2) Comparar dois métodos fluorogénicos alternativos, Quanti Disc e SimPlate, para a contagem total de organismos viáveis e selecionar os mais adequados para a sua implementação no laboratório. (3) Criar «Procedimentos de Operação Padronizados» (POPs) para três métodos microbiológicos habitualmente utilizados no laboratório de microbiologia com base na norma ISO 17025:2005, para serem integrados na documentação do sistema de qualidade do laboratório. (4) Validar um método alternativo, criado para amostras de água, Colilert-18 ®, para contagem total de bactérias coliformes e E.coli em tecidos de bivalves. De acordo com estudos anteriores realizados no laboratório e o descrito por vários autores, os resultados obtidos para validação do método Colilert-18 ® sugerem que devem ser feitos mais estudos neste domínio. O coeficiente de variação obtido a partir da análise dos dados foi de 30%. Quanto à exactidão do método e com base no teste estatístico realizado, foram encontradas diferenças significativas entre o valor médio obtido e a média do material de referência. Por outro lado, os resultados estão dentro do intervalo de concentração indicado pelo fabricante. As Cartas Guia foram elaboradas com base nos resultados obtidos nos testes com os materiais de referência. Os resultados da comparação dos dois métodos alternativos para a enumeração de bactérias viáveis através de Quanti Disc e Simplate, baseados em criterios descritos na norma ISO 17994:2004, revelam que devem ser analisadas mais amostras para a enumeração de bactérias que crescem a 36 º C, uma vez que os resultados não são conclusivos. No entanto, ambos os métodos são estatisticamente diferentes quando as bactérias são incubadas a 22 º C. De acordo com os resultados obtidos, é possível confirmar que SimPlate proporciona maiores taxas de recuperação, especialmente a 22 º C. Analisando todo o processo, QuantiDisc é mais fácil de realizar do que SimPlate e por outro lado o tempo de manipulação é mais curto. O processo de contagem é muito mais fácil e claro quando se usa QuantiDisc. Foram criados Procedimentos Operacionais Padrão (POPs) para os métodos microbiológicos utilizados rotineiramente no laboratório de microbiologia de acordo com a norma ISO 17025:2005, para serem integrados na documentação do Sistema de Qualidade do laboratório. Colilert-18, Enterolert e Quanti Disc (IDEXX Laboratories) foram os métodos considerados. Foi também validado o método alternativo Colilert-18 para tecidos de bivalves; mexilhões e amêijoas, por comparação com o Método Donovan et al normalizado ne ISO/TR 16649-3:2005 para a enumeração de coliformes totais e E. coli em bivalves vivos. De acordo com os criterios definidos na ISO17994:2004 para o nível de confiança de 95%, os resultados obtidos para a enumeração de coliformes totais em amostras de amêijoa foram diferentes mas os obtidos para coliformes totais em mexilhão e enumeração de E.coli em amostras de amêijoa e mexilhão foram inconclusivos. Estes resultados sugerem a necessidade de um estudo com maior número de amostras para determinar a equivalência entre os dois métodos. Obteve-se a melhor correlação para a determinação de E. coli em amostras de mexilhões (R2 = 0,73), seguida da enumeração de coliformes totais em mexilhões (R2= 0,69), coliformes totais em ameijoas (R2 = 0,57) e, finalmente, E. coli em ameijoas (R2 = 0,15). Serão necessários mais estudos para avaliar a viabilidade da utilização de Colilert-18 como um método alternativo para a enumeração de coliformes totais e E. coli em bivalves, devido às suas grandes vantagens.