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Gene therapy for Cockayne syndrome: in vivo studies
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Abstract(s)
Cockayne Syndrome (CS) is a rare, severe, multi-systemic disorder inherited in an autosomal recessive pattern, with an incidence of 2.77 cases per million births. First documented by Dr. Edward Cockayne in 1936, this syndrome presents a variety of clinical features, primarily impacting the vision, hearing, growth, and motor and cognitive functions. Neuropathologically, it involves white matter loss, microcephaly, and brain calcifications. CS can be categorized into three severity groups: CS type II (most severe), CS type I (moderate), and CS type III (least severe). It can also be classified according to the underlying genetic mutation: ERCC8 mutation causes CS type A (CS-A) and ERCC6 mutation leads to CS type B (CS-B), with 65% of cases being CS-B. This study focuses on CS-B, due to its therapeutic relevance. The ERCC6 gene, which translates the CSB protein, is crucial in several cellular mechanisms, such as DNA damage repair (induced by ultraviolet radiation or oxidative stress), transcription regulation, and mitochondrial function. Mutations in ERCC6 lead to DNA damage accumulation, transcriptional arrest, and mitochondrial dysfunction. Currently, treatments are limited to symptom management, highlighting the need for gene-based therapies. Gene therapy aims to treat genetic disorders by delivering genetic material to human cells, through vectors. There are several gene therapy strategies and more than a dozen have been approved for clinical use. As a monogenic disorder with recessive inheritance, CS-B poses a strong candidate for a gene therapy-based treatment. Therefore, the aim of this work is to determine the therapeutic potential of a gene therapy for CS-B in vivo. This strategy is based on delivering a functional ERCC6 gene through an AAV9 vector. The first step in this study was to test eight therapeutic strategies in vitro, with the objective of narrowing it down to one (Cure1) for further in vivo testing in a CS-B mouse model, CSB m/m. Following, we injected a CS-B mouse model with Cure1 and these preliminary results showed promising CSB expression in the injected brain hemisphere. Lastly, given the success of preliminary tests, this strategy was injected CSB m/m mice for further behavioural assessment. However, these tests showed no significant improvements, suggesting Cure1’s limited effectiveness. Additionally, histological analysis of these brains showed no expression of CSB in mice injected with Cure1, further supporting the inference that Cure1 has limited therapeutic potential. In conclusion, the findings indicate that Cure1 gene therapy does not significantly enhance CSB expression or improve the phenotype in CS-B mice. Further studies are required to confirm the reliability of these results and assess Cure1's therapeutic potential comprehensively.
A síndrome de Cockayne (CS, do inglês Cockayne Syndrome) é uma doença devastadora e multissistémica, de herança autossómica recessiva. É uma doença rara, com uma incidência estimada de 2.77 casos por cada milhão de nados vivos. Esta doença foi documentada pela primeira vez em 1936 pelo Dr. Edward Cockayne, que a caracterizou em dois irmãos, que apresentavam o que foi descrito como nanismo caquético, acompanhado por atrofia da retina e surdez. Sendo uma doença multissistémica, apresenta uma grande variabilidade de manifestações clínicas, afetando, a audição, a visão, a estatura e desenvolvimento, o sistema musculo-esquelético e, principalmente, o sistema nervoso. A disfunção neuronal nesta doença é caracterizada principalmente por deficiências intelectuais e cognitivas e disfunção motora. A nível neuropatológico, destacam-se perda de matéria branca, microcefalia, alterações na bainha de mielina e calcificações em diversas regiões do cérebro. As caracterizações iniciais desta doença permitiram classificá-la em três tipos: CS tipo I, CS tipo II e CS tipo III, que apresentam diferentes níveis de severidade entre si. Destas, CS tipo II é a forma mais severa, que resulta em morte na primeira década de vida, CS tipo I é uma forma mais moderada, e CS tipo III é a forma menos severa desta doença. Para além disso, esta doença também pode ser classificada com base na mutação genética que a causa: uma mutação no gene ERCC8 leva a CS tipo A (CS-A), enquanto uma mutação no gene ERCC6 leva a CS tipo B (CS-B). Destas, 65% dos casos de CS correspondem a CS-B, na qual o foco deste trabalho vai incidir, devido à sua relevância terapêutica. O gene ERCC6 tem cerca de 104 kilobases e localiza-se na região cromossómica 10q11.23 e até 2013, 78 diferentes mutações já tinham sido descritas neste gene. Este gene é traduzido na proteína CSB, que tem um peso molecular de 168 kDa. Esta proteína tem expressão ubíqua e, a nível celular, localiza-se no nucleoplasma e no nucléolo. A nível de funções, CSB participa num grande número de processos celulares, tais como a resposta ao dano no DNA induzido por radiação ultravioleta (UV), ou por dano oxidativo; regulação da transcrição; remodelação da cromatina; transcrição de DNA ribossomal; entre outras. Dada a sua participação em diversos processos cruciais para o normal funcionamento das células, mutações neste gene levam a uma patogénese molecular bastante complexa, caracterizada, principalmente por uma maior sensibilidade e acumulação de dano no DNA, paragem na transcrição e anomalias a nível da mitocôndria. Relativamente a terapias, atualmente, o tratamento desta doença cinge-se essencialmente à gestão de sintomas e prevenção de complicação. Dada a severidade desta doença e a idade a que se xxii torna fatal, é tão importante quanto relevante o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem abordar os mecanismos moleculares que lhe estão subjacentes. Daí surge a terapia génica, que tem como objetivo cura de doenças com bases genéticas, através da entrega de material genético a células humanas, com o objetivo de corrigir, modificar ou regular a expressão génica. Atualmente, existem mais de uma dezena de terapias génicas aprovadas, para uma miríade de doenças, como a atrofia muscular espinal (SMA, do inglês Spinal Muscular Atrophy) e a β-talassemia. Existem diversos tipos de terapia génica, podendo estas ser administradas ex vivo (fora do organismo), ou in vivo (diretamente ao organismo); em células somáticas ou reprodutoras (apesar desta ser proibida nos países ocidentais). Relativamente às estratégias em si, estas podem ser de aumento (entrega da versão normal de um gene que se encontre mutado); de silenciamento (silenciar um gene cuja expressão tenha um efeito detrimental); ou baseadas em edição génica (permite a correção específica de um determinado defeito). A entrega destas terapias é feita por vetores, que podem ser tanto virais, como não virais. A terapia génica tem vindo a mostrar cada vez mais sucesso no tratamento de doenças neurológicas, apresentando efeitos benéficos em doenças como a SMA. Como uma doença monogénica de herança autossómica recessiva, CS-B é uma candidata bastante relevante para o tratamento por terapia génica. Deste modo, o objetivo deste trabalho consiste em avaliar a eficácia e potencial terapêutico de uma terapia génica pra CS-B in vivo. Esta estratégia consiste na entrega de uma cópia funcional do gene ERCC6, através de um vetor AAV9 (do inglês, adeno-associated vírus serotype 9). O primeiro passo neste trabalho foi avaliar várias estratégias terapêuticas num modelo de CS-B in vitro, de modo a selecionar uma para testes mais especializados in vivo. Foram analisadas no total 8 estratégias e dessas, apenas 4 mostraram recuperação da expressão de CSB. A estratégia selecionada, denominada de Cure1, apresentava uma expressão moderada, bem como um tamanho do transgene mais pequeno. De seguida, foram realizados testes preliminares num modelo de murganho de CSB, denominado de CSBm/m. Para tal, os animais foram injetados com a estratégia terapêutica num dos hemisférios cerebrais, de modo a avaliar a expressão de CSB. OS resultados foram bastante promissores, já que se observou um aumento nítido na expressão de CSB no hemisfério injetado, comparativamente ao não injetado. Este teste permitiu passar à fase seguinte: os testes comportamentais no modelo CSBm/m, em murganhos injetados com esta estratégia terapêutica. Como termos de comparação e controlo experimental, foram utilizados murganhos não injetados e murganhos injetados com eGFP. Os murganhos foram então sujeitos a testes comportamentais (tanto motores como cognitivos). No entanto, os resultados xxiii obtidos não foram, de todo, favoráveis, sendo que não se observaram alterações significativas no contexto do estudo entre os animais injetados com Cure1 e os não injetados, o que sugere que Cure1 não é eficaz em mitigar o fenótipo de CS-B no modelo CSBm/m. Para além disso, os resultados mostraram-se bastante inconsistentes ao longo dos testes, o que pode ser devido a uma combinação de diversos fatores, como por exemplo, o facto deste modelo não representar a doença de forma completa, apresentando sintomas mais moderados. Por fim, foram analisados os cérebros dos animais sujeitos a testes comportamentais, de modo a avaliar a expressão de CSB. Surpreendentemente, não se observou qualquer alteração entre os cérebros dos animais dos três grupos experimentais. Isto sugere que Cure1 não leva a um aumento de expressão de CSB, o que pode consistir uma explicação para a semelhança no desempenho nos murganhos injetados com a estratégia terapêutica, comparativamente aos não injetados. Concluindo, os resultados sugerem que a terapia génica em estudo não leva à expressão de CSB e, consequentemente, a uma melhoria no fenótipo em murganhos CSBm/m. No entanto, é necessário realizar testes mais aprofundados para determinar até que ponto este efeito é fidedigno, dado que os resultados aqui apresentados não são suficientes para fazer inferências fundamentadas relativamente ao efeito terapêutico, ou a falta dele, da estratégia de terapia genética Cure1.
A síndrome de Cockayne (CS, do inglês Cockayne Syndrome) é uma doença devastadora e multissistémica, de herança autossómica recessiva. É uma doença rara, com uma incidência estimada de 2.77 casos por cada milhão de nados vivos. Esta doença foi documentada pela primeira vez em 1936 pelo Dr. Edward Cockayne, que a caracterizou em dois irmãos, que apresentavam o que foi descrito como nanismo caquético, acompanhado por atrofia da retina e surdez. Sendo uma doença multissistémica, apresenta uma grande variabilidade de manifestações clínicas, afetando, a audição, a visão, a estatura e desenvolvimento, o sistema musculo-esquelético e, principalmente, o sistema nervoso. A disfunção neuronal nesta doença é caracterizada principalmente por deficiências intelectuais e cognitivas e disfunção motora. A nível neuropatológico, destacam-se perda de matéria branca, microcefalia, alterações na bainha de mielina e calcificações em diversas regiões do cérebro. As caracterizações iniciais desta doença permitiram classificá-la em três tipos: CS tipo I, CS tipo II e CS tipo III, que apresentam diferentes níveis de severidade entre si. Destas, CS tipo II é a forma mais severa, que resulta em morte na primeira década de vida, CS tipo I é uma forma mais moderada, e CS tipo III é a forma menos severa desta doença. Para além disso, esta doença também pode ser classificada com base na mutação genética que a causa: uma mutação no gene ERCC8 leva a CS tipo A (CS-A), enquanto uma mutação no gene ERCC6 leva a CS tipo B (CS-B). Destas, 65% dos casos de CS correspondem a CS-B, na qual o foco deste trabalho vai incidir, devido à sua relevância terapêutica. O gene ERCC6 tem cerca de 104 kilobases e localiza-se na região cromossómica 10q11.23 e até 2013, 78 diferentes mutações já tinham sido descritas neste gene. Este gene é traduzido na proteína CSB, que tem um peso molecular de 168 kDa. Esta proteína tem expressão ubíqua e, a nível celular, localiza-se no nucleoplasma e no nucléolo. A nível de funções, CSB participa num grande número de processos celulares, tais como a resposta ao dano no DNA induzido por radiação ultravioleta (UV), ou por dano oxidativo; regulação da transcrição; remodelação da cromatina; transcrição de DNA ribossomal; entre outras. Dada a sua participação em diversos processos cruciais para o normal funcionamento das células, mutações neste gene levam a uma patogénese molecular bastante complexa, caracterizada, principalmente por uma maior sensibilidade e acumulação de dano no DNA, paragem na transcrição e anomalias a nível da mitocôndria. Relativamente a terapias, atualmente, o tratamento desta doença cinge-se essencialmente à gestão de sintomas e prevenção de complicação. Dada a severidade desta doença e a idade a que se xxii torna fatal, é tão importante quanto relevante o desenvolvimento de estratégias terapêuticas que visem abordar os mecanismos moleculares que lhe estão subjacentes. Daí surge a terapia génica, que tem como objetivo cura de doenças com bases genéticas, através da entrega de material genético a células humanas, com o objetivo de corrigir, modificar ou regular a expressão génica. Atualmente, existem mais de uma dezena de terapias génicas aprovadas, para uma miríade de doenças, como a atrofia muscular espinal (SMA, do inglês Spinal Muscular Atrophy) e a β-talassemia. Existem diversos tipos de terapia génica, podendo estas ser administradas ex vivo (fora do organismo), ou in vivo (diretamente ao organismo); em células somáticas ou reprodutoras (apesar desta ser proibida nos países ocidentais). Relativamente às estratégias em si, estas podem ser de aumento (entrega da versão normal de um gene que se encontre mutado); de silenciamento (silenciar um gene cuja expressão tenha um efeito detrimental); ou baseadas em edição génica (permite a correção específica de um determinado defeito). A entrega destas terapias é feita por vetores, que podem ser tanto virais, como não virais. A terapia génica tem vindo a mostrar cada vez mais sucesso no tratamento de doenças neurológicas, apresentando efeitos benéficos em doenças como a SMA. Como uma doença monogénica de herança autossómica recessiva, CS-B é uma candidata bastante relevante para o tratamento por terapia génica. Deste modo, o objetivo deste trabalho consiste em avaliar a eficácia e potencial terapêutico de uma terapia génica pra CS-B in vivo. Esta estratégia consiste na entrega de uma cópia funcional do gene ERCC6, através de um vetor AAV9 (do inglês, adeno-associated vírus serotype 9). O primeiro passo neste trabalho foi avaliar várias estratégias terapêuticas num modelo de CS-B in vitro, de modo a selecionar uma para testes mais especializados in vivo. Foram analisadas no total 8 estratégias e dessas, apenas 4 mostraram recuperação da expressão de CSB. A estratégia selecionada, denominada de Cure1, apresentava uma expressão moderada, bem como um tamanho do transgene mais pequeno. De seguida, foram realizados testes preliminares num modelo de murganho de CSB, denominado de CSBm/m. Para tal, os animais foram injetados com a estratégia terapêutica num dos hemisférios cerebrais, de modo a avaliar a expressão de CSB. OS resultados foram bastante promissores, já que se observou um aumento nítido na expressão de CSB no hemisfério injetado, comparativamente ao não injetado. Este teste permitiu passar à fase seguinte: os testes comportamentais no modelo CSBm/m, em murganhos injetados com esta estratégia terapêutica. Como termos de comparação e controlo experimental, foram utilizados murganhos não injetados e murganhos injetados com eGFP. Os murganhos foram então sujeitos a testes comportamentais (tanto motores como cognitivos). No entanto, os resultados xxiii obtidos não foram, de todo, favoráveis, sendo que não se observaram alterações significativas no contexto do estudo entre os animais injetados com Cure1 e os não injetados, o que sugere que Cure1 não é eficaz em mitigar o fenótipo de CS-B no modelo CSBm/m. Para além disso, os resultados mostraram-se bastante inconsistentes ao longo dos testes, o que pode ser devido a uma combinação de diversos fatores, como por exemplo, o facto deste modelo não representar a doença de forma completa, apresentando sintomas mais moderados. Por fim, foram analisados os cérebros dos animais sujeitos a testes comportamentais, de modo a avaliar a expressão de CSB. Surpreendentemente, não se observou qualquer alteração entre os cérebros dos animais dos três grupos experimentais. Isto sugere que Cure1 não leva a um aumento de expressão de CSB, o que pode consistir uma explicação para a semelhança no desempenho nos murganhos injetados com a estratégia terapêutica, comparativamente aos não injetados. Concluindo, os resultados sugerem que a terapia génica em estudo não leva à expressão de CSB e, consequentemente, a uma melhoria no fenótipo em murganhos CSBm/m. No entanto, é necessário realizar testes mais aprofundados para determinar até que ponto este efeito é fidedigno, dado que os resultados aqui apresentados não são suficientes para fazer inferências fundamentadas relativamente ao efeito terapêutico, ou a falta dele, da estratégia de terapia genética Cure1.
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Keywords
Cockayne Syndrome (CS) Cockayne Syndrome type B (CS-B) Gene teraphy ERCC6 CSB