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Assessing the usefulness of traditional (ossicles) and molecular (barcoding) criteria to the right taxonomic identification of Mediterranean and North-Eastern Atlantic commercial sea cucumbers belonging to the genus Holothuria
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Authors
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Abstract(s)
The shallow waters sea cucumbers included on the Holothuria genus has become a new important fishing resource, because the overfishing on the Indo-Pacific populations and the increasing Asian demand. In spite of the importance of this group, its taxonomy has suffered several changes during the last 50 years and, nowadays, it is still under discussion. A right definition of species boundaries is a key step for obtaining other biological information for the appropriate fisheries management.
On this master thesis, the validity of one traditional character –ossicles morphometry- and molecular characters –DNA barcoding of two mitochondrial genes- have been tested for the right taxonomic identification of H. sanctori, H. mammata, H. tubulosa, H. arguinensis and H. polii. Also, the possible variation of these characters in relation to the geographical range of species was considered.
Our results suggest that the ossicles are useful character to discriminate H. santori, H. polii and H. tubulosa, but they are not for H. arguinensis and H. mammata. These last two species showed high rates of intra-specific variability. Part of this variability could be linked to geographical factors, showing morphometric differences between the Atlantic and Mediterranean populations. Molecular barcoding from partial sequences of COI and 16S genes, distinguished five well supported clades. Genetic barcoding seems to be more effective for taxonomical identification of these target species than the morphological criteria. The information obtained from this Msc Thesis provides more accurate boundaries between species and practical tools for their identification, which will allow to develop more efficient fisheries management.
Os pepinos do mar o holoturias são invertebrados bentónicos exclusivamente marinhos incluidos no grupo dos Echinodermos. O grupo contém um total de 1400 espécies distrubuidas em 6 ordens. A familia Holothuroidea, incluída na ordem Aspidochirotida, é dividida em 5 géneros entre os quais, está incluido o género Holothuria. O género Holothuria inclui maioritariamente espécies de águas pouco profundas e algumas das espécies são distribuidas no Mediterraneo e no noreste do océano Atlantico. Os pepinos de mar realizan uma importante função ecológica no ciclo dos nutrientes e da materia orgânica, além de representar uma importante quantidade da biomasa de invertebrados no seu habitat. Nos últimos anos o pepino de mar tem sido o objetivo de uma intensa pesca, devido ao seu valor comercial na Asia. A forte demanda mudou a pesca para países onde eles não foram comsumidos tradicionalmente, entre os quais se incluem Portugal e Espanha. Apesar da importancia ecologica e económica das especies incluídas no género, a sua taxonomía mudou várias vezes no final do século XX e ainda esta em discussão. As dificultades da taxonomía no genero devem-se principalmente ao número limitado de caracteres morfológicos da taxonomía e a grande variabilidade intra-especifica dos caracteres. Um dos principais caracteres na taxonomía das Holoturia são os osiculos, uma estrutura de carbonato cálcico que se encontra na pele e outras partes do corpo nos pepinos do mar. Porém há varios autores que têm questionado a sua validade, devido a alterações significativas durante o crecimento dos individuos, e os possíveis efeitos das variáveis ambientais na morfología dos osiculos. Nesta tese de mestrado, nos vamos a avaliar a utilidade de alguns caracteres da taxonomía dos pepinos de mar: um carácter tradicional, os osiculos, e um carácter molecular, com o “barcoding” das sequências parcias de dois genes mitocôndriais o COI (Citocromo Oxidasa I) e o 16S (DNA ribosomal). Os objectivos são encontrar caracteres úteis para a correcta identificação das 5 espécies do género Holothuria com interesso comercial, H. arguinensis, H. mammata, H. tubulosa, H. polii and H. sanctori, e avaliar a sua variabilidade em relação com a distribuição geográfica Um total de 47 individuos foram recolhidos nas diferentes localidades que incluem os limites da distribuição das especies. A análise dos caracteres tradicionais foi realizado únicamente em dois tipos de osiculos, os botões e as mesas devido à sua maior importancia para a identificação das holoturias de acordo com as referências bibliográficas. Um total de 8 variáveis morfométricas nos botões e 11 variáveis nas mesas foram medidas. As variáveis morfométricas medidas nos dois tipos de osiculos foram a área, o perímetro, o perímetro convexo, o diámetro máximo, o diámetro mínimo, o número de buracos, a área total dos buracos e a área média dos buracos. Além disso, no caso das mesas, foram medidas mais 3 variáveis, a altura da mesas, a largura do disco das mesas e a largura da espiral das mesas. Finalmente a partir destas variáveis foram calculados 5 índices morfométricos para os botões e 6 para as mesas. O análise dos componentes principais determino que existe uma ordenação das espécies no espaço em relação às variáveis estudadas. O espaço principal foi determinado por 11 variáveis, sendo estas, área total dos buracos dos botões (TArHb), área média dos buracos dos botões (ArHb), área total dos buracos das mesas (TArHt) e a área média dos buracos das mesas (ArHt), o diámetro mínimo das mesas (NDt), a altura das mesas (HTLt), a largura da espiral das mesas (WSLt), a largura do disco das mesas (WDLt), o perímetro da mesa (Pt), o perímetro dos botões e o diámetro máximo dos botões . As variáveis selecionadas foram incluidas no analise lineal discrimiante. Os resultados determinaron que únicamente 3 das especies, H. sanctori, H. polii e H. tubulosa, podem ser diferenciadas de acordo com as variables medidas nos osiculos. Porém, a distribuição das espécies mostrou especialmente uma grande dispersão no espaço da análise dos componentes principais e uma grande variabilidade das variáveis dentro das espécies. Com o objetivo de explicar as causas da dispersão dos dados, as localidades da amostragem foram representadas no espaço dos componentes principais. A distribuição dos locais da amostragem mostrou a existência de quatro grupos, dos quais 3 foram formados apenas por localidades do Mediterrâneo e do Atlântico. Foi realizada uma nova análise com as duas espécies (Holothuria mammata e H. arguinensis) comuns na amostragem que se incluiam tanto na amostra Mediterrânea como na Atlântica. Os resultados mostraram uma diferenciação na morfometria dos osiculos entre os indivíduos recolhidos no Mediterrâneo e os recolhidos no Atlântico dentro da mesma espécie. Portanto, os nossos resultados sugerem que a morfometria dos osiculos pode ser afectada pelas diferenças ambientais entre o Atlântico e o Mediterrâneo. Os orifícios dos osiculos dos individuos recolhidos no Atlântico são maiores em relação aos individuos do Mediterrâneo. Um total de 19 sequências do 16S, 18 do COI e 12 da combinação das sequências do COI e 16S, foram analizadas mediante o método do vizinho mais próximo, mediante distâncias genéticas baseadas em Kimura dois-parâmetros. Os resultados em todas as analises mostraram a existência de 5 clados bem definidos pela distância genética. As maoires distancias genéticas foram encontradas entre H. sanctori e todas as espécies, seguido de H. polii. As distancias entre H. mammata, H. tubulosa e H. arguinensis mudo dependiodo na sequência analizada. A menor distancia no COI foi encontrada entre H. mammata e H. arguinensis, mais no 16S foi entre H. arguinensis e H. mammata. No entanto o COI parece ser mais eficiente na identificação das especies pela sua maior taxa de mutação. A identificaçao dos individuos mediante as técnicas moleculares coincidem com as identificaçõess previas mediante caracteres morfológicos, com a exceção, dum individuo previamente identificado como H. arguinesis, o qual foi agrupado junto os individuos da H. mammata em todas as sequêcias. O analise dos osiculos demostrou que uma possível explicação e, a existencia de um híbrido entre as duas especies, mais não foi possível demostrar este facto com os analise realizados nesta tese. Nossos resultados sugierem que os osiculos tem una capacidade limitada para a identificação das diferentes espécies, principalmene devido a sua grande variabilidade. Parte desta variabilidade podria estar relacionado com a distribução dos individuos e as diferentes características ambientais. As técnicas moleculares foram mais efectivas para a identificação das espécies, espcialmente as sequêcias obtenidas do COI. A comparação dos resultados morfológicos é genéticos sugerem a existencia de um híbrido entre as espécies H. arguinensis e H. mammata, mais é preciso futuras pesquisas científicas para comprovar esta possibilidade.
Os pepinos do mar o holoturias são invertebrados bentónicos exclusivamente marinhos incluidos no grupo dos Echinodermos. O grupo contém um total de 1400 espécies distrubuidas em 6 ordens. A familia Holothuroidea, incluída na ordem Aspidochirotida, é dividida em 5 géneros entre os quais, está incluido o género Holothuria. O género Holothuria inclui maioritariamente espécies de águas pouco profundas e algumas das espécies são distribuidas no Mediterraneo e no noreste do océano Atlantico. Os pepinos de mar realizan uma importante função ecológica no ciclo dos nutrientes e da materia orgânica, além de representar uma importante quantidade da biomasa de invertebrados no seu habitat. Nos últimos anos o pepino de mar tem sido o objetivo de uma intensa pesca, devido ao seu valor comercial na Asia. A forte demanda mudou a pesca para países onde eles não foram comsumidos tradicionalmente, entre os quais se incluem Portugal e Espanha. Apesar da importancia ecologica e económica das especies incluídas no género, a sua taxonomía mudou várias vezes no final do século XX e ainda esta em discussão. As dificultades da taxonomía no genero devem-se principalmente ao número limitado de caracteres morfológicos da taxonomía e a grande variabilidade intra-especifica dos caracteres. Um dos principais caracteres na taxonomía das Holoturia são os osiculos, uma estrutura de carbonato cálcico que se encontra na pele e outras partes do corpo nos pepinos do mar. Porém há varios autores que têm questionado a sua validade, devido a alterações significativas durante o crecimento dos individuos, e os possíveis efeitos das variáveis ambientais na morfología dos osiculos. Nesta tese de mestrado, nos vamos a avaliar a utilidade de alguns caracteres da taxonomía dos pepinos de mar: um carácter tradicional, os osiculos, e um carácter molecular, com o “barcoding” das sequências parcias de dois genes mitocôndriais o COI (Citocromo Oxidasa I) e o 16S (DNA ribosomal). Os objectivos são encontrar caracteres úteis para a correcta identificação das 5 espécies do género Holothuria com interesso comercial, H. arguinensis, H. mammata, H. tubulosa, H. polii and H. sanctori, e avaliar a sua variabilidade em relação com a distribuição geográfica Um total de 47 individuos foram recolhidos nas diferentes localidades que incluem os limites da distribuição das especies. A análise dos caracteres tradicionais foi realizado únicamente em dois tipos de osiculos, os botões e as mesas devido à sua maior importancia para a identificação das holoturias de acordo com as referências bibliográficas. Um total de 8 variáveis morfométricas nos botões e 11 variáveis nas mesas foram medidas. As variáveis morfométricas medidas nos dois tipos de osiculos foram a área, o perímetro, o perímetro convexo, o diámetro máximo, o diámetro mínimo, o número de buracos, a área total dos buracos e a área média dos buracos. Além disso, no caso das mesas, foram medidas mais 3 variáveis, a altura da mesas, a largura do disco das mesas e a largura da espiral das mesas. Finalmente a partir destas variáveis foram calculados 5 índices morfométricos para os botões e 6 para as mesas. O análise dos componentes principais determino que existe uma ordenação das espécies no espaço em relação às variáveis estudadas. O espaço principal foi determinado por 11 variáveis, sendo estas, área total dos buracos dos botões (TArHb), área média dos buracos dos botões (ArHb), área total dos buracos das mesas (TArHt) e a área média dos buracos das mesas (ArHt), o diámetro mínimo das mesas (NDt), a altura das mesas (HTLt), a largura da espiral das mesas (WSLt), a largura do disco das mesas (WDLt), o perímetro da mesa (Pt), o perímetro dos botões e o diámetro máximo dos botões . As variáveis selecionadas foram incluidas no analise lineal discrimiante. Os resultados determinaron que únicamente 3 das especies, H. sanctori, H. polii e H. tubulosa, podem ser diferenciadas de acordo com as variables medidas nos osiculos. Porém, a distribuição das espécies mostrou especialmente uma grande dispersão no espaço da análise dos componentes principais e uma grande variabilidade das variáveis dentro das espécies. Com o objetivo de explicar as causas da dispersão dos dados, as localidades da amostragem foram representadas no espaço dos componentes principais. A distribuição dos locais da amostragem mostrou a existência de quatro grupos, dos quais 3 foram formados apenas por localidades do Mediterrâneo e do Atlântico. Foi realizada uma nova análise com as duas espécies (Holothuria mammata e H. arguinensis) comuns na amostragem que se incluiam tanto na amostra Mediterrânea como na Atlântica. Os resultados mostraram uma diferenciação na morfometria dos osiculos entre os indivíduos recolhidos no Mediterrâneo e os recolhidos no Atlântico dentro da mesma espécie. Portanto, os nossos resultados sugerem que a morfometria dos osiculos pode ser afectada pelas diferenças ambientais entre o Atlântico e o Mediterrâneo. Os orifícios dos osiculos dos individuos recolhidos no Atlântico são maiores em relação aos individuos do Mediterrâneo. Um total de 19 sequências do 16S, 18 do COI e 12 da combinação das sequências do COI e 16S, foram analizadas mediante o método do vizinho mais próximo, mediante distâncias genéticas baseadas em Kimura dois-parâmetros. Os resultados em todas as analises mostraram a existência de 5 clados bem definidos pela distância genética. As maoires distancias genéticas foram encontradas entre H. sanctori e todas as espécies, seguido de H. polii. As distancias entre H. mammata, H. tubulosa e H. arguinensis mudo dependiodo na sequência analizada. A menor distancia no COI foi encontrada entre H. mammata e H. arguinensis, mais no 16S foi entre H. arguinensis e H. mammata. No entanto o COI parece ser mais eficiente na identificação das especies pela sua maior taxa de mutação. A identificaçao dos individuos mediante as técnicas moleculares coincidem com as identificaçõess previas mediante caracteres morfológicos, com a exceção, dum individuo previamente identificado como H. arguinesis, o qual foi agrupado junto os individuos da H. mammata em todas as sequêcias. O analise dos osiculos demostrou que uma possível explicação e, a existencia de um híbrido entre as duas especies, mais não foi possível demostrar este facto com os analise realizados nesta tese. Nossos resultados sugierem que os osiculos tem una capacidade limitada para a identificação das diferentes espécies, principalmene devido a sua grande variabilidade. Parte desta variabilidade podria estar relacionado com a distribução dos individuos e as diferentes características ambientais. As técnicas moleculares foram mais efectivas para a identificação das espécies, espcialmente as sequêcias obtenidas do COI. A comparação dos resultados morfológicos é genéticos sugerem a existencia de um híbrido entre as espécies H. arguinensis e H. mammata, mais é preciso futuras pesquisas científicas para comprovar esta possibilidade.
Description
Dissertação de mestrado, Biologia Marinha, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016
Keywords
Holothuria Taxonomía Morfometria Barcoding Variabilidade