Publication
Searching for bacteria degrading carbamazepine, diclofenac sodium, and 17a-ethinylestradiol from sewage sludge digestor sample and in silico identification of genes potentially involved in the biodegradation of these drugs
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais | |
| dc.contributor.advisor | Costa, Maria Clara Semedo da Silva | |
| dc.contributor.advisor | Carlier, Jorge Daniel Dias | |
| dc.contributor.author | Udundzic, Anja | |
| dc.date.accessioned | 2025-04-23T17:35:48Z | |
| dc.date.available | 2025-04-23T17:35:48Z | |
| dc.date.issued | 2024-09-25 | |
| dc.description | EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121; BIODATA.PT ALG-01-0145- FEDER-022231. | |
| dc.description.abstract | The steady global increase of various contaminants of concern (CEC), including pharmaceuticals, has raised serious concerns about their residues potentially posing an environmental threat, particularly in water. While wastewater treatment plants (WWTPs) should manage and control these contaminants, conventional treatment methods often fail to adequately eliminate the persistent toxic compounds, emphasizing the need for improving managing approaches. Bioaugmentation, involving the introduction of specific microorganisms, has immense potential for enhancing wastewater treatment by facilitating the biological breakdown of toxins into less harmful substances. The objective of this study was to search for bacterial strains in a sewage sludge digestor sample that are competent in biodegrading three commonly found pharmaceutical compounds in wastewater effluents; carbamazepine (CBZ), diclofenac sodium (DCS), and 17α-ethinylestradiol (EE2), along with in silico identification of genes potentially involved in their biodegradation. Initially, tests with different mobile phases were performed to refine the HPLC methods used to quantify the targeted pharmaceuticals and calibration curves were made for each method. Following, biosorption assays determined the affinity of the pharmaceuticals to an inactivated sewage sludge digestor sample, where the highest affinity was detected in EE2, binding 64%, while the CBZ and DCS were bound by just over 10% each. Successive enrichment cultures starting from active sludge in selective liquid media (with CBZ, DCS, or EE2 as the sole carbon source) were prepared and used to inoculate plates of selective solid media. Thirty-seven (37) strains were isolated, grown, and subsequently tested as pure cultures in liquid media, where the biodegradation assays showed low or no degradative capabilities. Strain CBZ 3.5.2, causing a 30% CBZ removal, was classified based on the 16S rRNA gene sequence as Achromobacter pulmonis, or Bordetella hinzii, and used for further tests with replicates. However, the confirmation tests failed to replicate the decrease in the CBZ concentration. Ultimately, in silico searches in the genomes of species for which there are reports of strains degrading CBZ and DCS were performed to identify genes likely associated with biodegradation of the targeted pharmaceuticals. This search generated a significant volume of results, highlighting opportunities for further investigation. | eng |
| dc.description.abstract | Nas últimas décadas, tem-se verificado um aumento dos resíduos e da poluição por substâncias naturais e químicas persistentes que se dispersam no ambiente. O tratamento inadequado destes resíduos e o desconhecimento do seu impacto nos seres humanos e na vida selvagem levaram a que fossem considerados contaminantes de preocupação emergente (CPE). Estas substâncias podem ter efeitos adversos, mesmo em concentrações baixas e, por isso, é vital monitorizá-las e controlá-las. Entre os muitos compostos (eco)tóxicos, os produtos farmacêuticos são considerados CPE. A elevada procura global por vários medicamentos tem levado à presença dos seus resíduos como uma potencial ameaça, especialmente para o ecossistema aquático. Diversos compostos farmacêuticos são detetados nos efluentes das estações de tratamento de águas residuais (ETARs) e, portanto, encontrados em águas superficiais, subterrâneas e potáveis. As ETARs têm um forte impacto na remoção de contaminantes e na melhoria da qualidade da água, mas muitas vezes falham na remoção adequada de contaminantes persistentes, resultando no seu derrame na natureza. Com um aumento constante no consumo, a acumulação de produtos farmacêuticos aumenta igualmente no ambiente, causando perturbações no ecossistema. É, portanto, imperativo, prevenir e regular adequadamente todas as rotas onde esses compostos e os seus produtos metabólicos aparecem. A eliminação de substâncias potencialmente tóxicas deve ser realizada com impacto mínimo no meio ambiente, ser facilmente aplicável e ter baixo custo. A biorremediação e os processos biológicos de tratamento de efluentes são considerados métodos adequados para remover e prevenir poluentes farmacêuticos do ecossistema aquático de forma inofensiva. Assim, este estudo teve como objetivo procurar, numa amostra de um digestor de lamas de ETAR, estirpes bacterianas competentes na biodegradação de carbamazepina (CBZ), diclofenac sódico (DCS) e 17α etinilestradiol (EE2), três compostos farmacêuticos comumente encontrados nos efluentes de águas residuais, e também a identificação in silico de genes potencialmente envolvidos na biodegradação desses medicamentos. Primeiro, fizeram-se testes com diferentes fases móveis para otimizar os métodos de HPLC no instrumento usado para analisar os compostos farmacêuticos (Phs) alvo e foram construídas curvas de calibração para cada um. Após a realização de vários ensaios usando diferentes proporções, o uso de metanol e água Mili-Q, na razão de 60:40 v/v, mostrou ser a melhor fase móvel para a análise de CBZ e EE2, e 80:20 v/v para a de DCS. Em seguida, fizeram-se ensaios de biossorção com uma amostra inativada de digestor de lamas de ETAR para avaliar a afinidade dos produtos farmacêuticos em relação à mesma: o EE2 mostrou a maior capacidade de biossorção (64%), enquanto a CBZ e o DCS apresentaram uma biossorção um pouco maior do que 10%. Amostras ativas do digestor de v lamas de ETAR foram utilizadas para produzir culturas de enriquecimento em meio mineral sintético (MMS) líquido com 10 mg L -1 de CBZ, DSC ou EE2, as quais foram incubadas durante 14 dias num agitador orbital a 30°C. Depois, para o isolamento de estirpes, o sobrenadante das culturas enriquecidas foi espalhado em meio sólido seletivo com CBZ, DCS ou EE2 como única fonte de carbono. Trinta e sete (37) diferentes morfotipos de colónias cresceram no meio sólido seletivo para os produtos farmacêuticos testados, sendo todos usados para realizar ensaios de biodegradação com culturas puras inoculadas em dois tipos de meio MMS na esperança de melhorar a seleção de isolados com boas capacidades degradantes. Um isolado, identificado como estirpe CBZ 3.5.2, alcançou uma remoção de 30% de carbamazepina, sendo classificado taxonomicamente pela análise do gene ARNr 16S como Achromobacter pulmonis, ou Bordatella hinzii, e utilizado para mais testes adicionais de biodegradação em meio líquido com replicados. No entanto, esses testes não revelaram diminuição na concentração de CBZ e, não havendo confirmação das possíveis capacidades degradantes da estirpe, o seu ADN não foi enviado para sequenciação do genoma. Assim, iniciou-se a procura in silico de genes possivelmente associados às vias metabólicas de biodegradação de CBZ e DCS em genomas de espécies disponíveis em bases de dados públicas para as quais há estirpes reportadas como degradando estes Phs alvo. Apesar de na revisão da literatura para EE2 também terem sido encontrados artigos com identificação de enzimas associadas à sua degradação, não se procedeu à procura in silico de genes para este fármaco pois a estratégia em prática revelou-se demasiado extensa. Na plataforma EnsembleBacteria de análise genómica comparativa, fizeram-se, primeiramente, pesquisas com os nomes das enzimas indicadas nas vias metabólicas, tendo como alvo os genomas das espécies para as quais essas vias foram propostas e, em seguida, tendo como alvo os genomas de outras espécies com estirpes degradadoras dos fármacos alvo, mas para as quais não foi proposta via metabólica. Nestas pesquisas encontraram-se, em muitos casos, extensas listas de genes na mesma espécie anotados em cada família de enzimas procuradas, o que indica que, nesses casos, há bastantes enzimas da mesma família com funções diversas, tornando inútil a procura por nomes anotados. Assim, a subsequente procura de homólogos focou-se apenas nos primeiros passos de biodegradação de CBZ, para os quais nas espécies em que foram propostas as via metabólicas, foi encontrado um baixo número de genes com base na anotação. Duas enzimas indicadas no início das vias metabólicas para CBZ foram utilizadas como referência nas procuras de homólogos (amidohidrolase e bifenil dioxigenase) com a ferramenta tBLASTn na plataforma EnsembleBacteria. Foram utilizadas as proteínas (Peroxiureidoacrilato/ureidoacrilato amidohidrolase RutB (gene rutB) e proteína putativa da família de amidohidrolase de creatinina do sistema de micofactocina MftE (gene mftE)) vi codificadas pelos dois genes anotados como amidohidrolase, em Gordonia polyisoprenivorans. Também foram utilizadas as proteínas (bifenil dioxigenase subunidades: alfa, beta e sistema ferredoxina) codificadas pelos 3 genes anotados como bifenil dioxigenase, em Paraburkholderia xenovorans. Estas proteínas foram usadas para procurar homólogas em genomas de outras espécies relatadas na literatura como tendo estirpes degradadoras de CBZ. Foram procuradas homólogas também em genomas das espécies Achromobacter e Bordatella, as duas espécies sugeridas na classificação do isolado. No primeiro rastreio de degradação de CBZ efetuado neste trabalho, revelou-se potencial. Quanto à amidohidrolase, para a proteina RutB, foram encontrados genes a codificar sequências potencialmente homólogas nos 8 genomas pesquisados, enquanto que, para a proteína MftE foram encontrados potenciais homólogos apenas em 4 dos genomas, o que torna a primeira num alvo de estudo prioritário em comparação à segunda. Relativamente à bifenil dioxigenase, houve hits para a subunidade alfa nos 8 genomas, e para as subunidades beta e sistema ferredoxina, houve hits em 6 dos oito genomas pesquisados. O facto de potenciais genes homólogos para estas enzimas terem sido encontrados em todos ou quase todos os genomas de espécies com estirpes que degradam CBZ, torna-os alvos interessantes para estudos funcionais, por exemplo com estirpes mutantes com genes eliminados ou com supra expressão genética. | por |
| dc.identifier.tid | 203910133 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/27074 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.relation | Bioaugmentation and conjugative plasmid transference using bacteria from extreme environments to enhance biodegradation of recalcitrant pollutants in WWTP granular sludge | |
| dc.relation | Algarve Centre for Marine Sciences | |
| dc.relation | Algarve Centre for Marine Sciences | |
| dc.relation | Centre for Marine and Environmental Research | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | Bacterial isolates | |
| dc.subject | Biodegradation | |
| dc.subject | Carbamazepine | |
| dc.subject | Diclofenac | |
| dc.subject | 17α-ethinylestradiol | |
| dc.subject | Sewage sludge digestor | |
| dc.subject | In silico searche | |
| dc.title | Searching for bacteria degrading carbamazepine, diclofenac sodium, and 17a-ethinylestradiol from sewage sludge digestor sample and in silico identification of genes potentially involved in the biodegradation of these drugs | eng |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardTitle | Bioaugmentation and conjugative plasmid transference using bacteria from extreme environments to enhance biodegradation of recalcitrant pollutants in WWTP granular sludge | |
| oaire.awardTitle | Algarve Centre for Marine Sciences | |
| oaire.awardTitle | Algarve Centre for Marine Sciences | |
| oaire.awardTitle | Centre for Marine and Environmental Research | |
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| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Qualidade em Análises |