Identificação e caracterização de duas isoformas da Ferritina da amêijoa R. decussatus e avaliação de algumas das suas propriedades biológicas

F. Simao, Marcio

http://hdl.handle.net/10400.1/2655

Use this identifier to reference this record.

Name:	Description:	Size:	Format:
Tese de mestrado de Márcio Simão.pdf		6.53 MB	Adobe PDF	Download

Send Feedback

Authors

F. Simao, Marcio

Advisor(s)

Cancela, Leonor

Leite, Ricardo B.

Abstract(s)

Este trabalho teve como objectivos principais a identificação e caracterização, pela primeira vez, da sequência completa de dois transcritos que codificam para isoformas da Ferritina na amêijoa R. decussatus. Uma vez identificadas as sequências das ORFs, as proteínas correspondentes foram expressas num sistema in vitro o que permitiu analisar algumas das suas propriedades biológicas como a capacidade de oxidação. Os dois transcritos diferentes identificados foram denominados de Ferritina alfa e beta, tendo respectivamente 915nt e 808nt e codificando para proteínas com 171 e 170 aminoácidos. A análise das sequências de ADNc dos transcritos revelou a conservação de um elemento de regulação do ferro (IRE) unicamente na subunidade beta, por outro lado na alfa a sequência que poderia estar associada a este domínio forma uma estrutura secundária diferente provavelmente sem capacidade de contribuir para a regulação do ferro. A análise da expressão dos transcritos alfa e beta foi realizada em 4 tecidos diferentes da amêijoa R. decussatus submetida a duas condições experimentais diferentes, um grupo controlo e um grupo sujeito a um tratamento com um suplemento de ferro (1mM FeCl2). Analisando em cada tecido (Brânquias, Pé, Sifões e Hepatopâcreas) a expressão dos transcritos da Ferritina alfa e beta em resposta ao tratamento com ferro foi possível observar que ocorre um aumento significativo de expressão da subunidade beta nessas condições nos tecidos do Pé (2,97, p<0,001), dos Sifões (2,61, p=0,003) e do Hepatopâncreas (2,31, p=0,011) enquanto para a subunidade alfa ocorre uma diminuição significativa da expressão nas Brânquias (0,40, p=0,010) e no Pé (0,45, p=0,015). A análise das sequências de aminoácidos codificadas pelos transcritos das Ferritinas alfa e beta revelaram uma identidade entre si de 78%, apresentando cada subunidade 4 hélices alfa principais (A, B, C e D) e uma quinta hélice (E) mais pequena na extremidade C-terminal, sendo as hélices B e C separadas por uma longa cadeia de aminoácidos sem estrutura secundária definida (coil). Foi também confirmada a conservação dos centros ferroxidase nas duas proteínas, assim como os domínios de nucleação do ferro e aminoácidos chave envolvidos na formação dos canais de transporte do ferro. iii A análise filogenética das sequências das Ferritinas alfa e beta da amêijoa R. decussatus indica que estas se enquadram filogeneticamente nos moluscos e no subgrupo das amêijoas, confirmando também que são duas proteínas independentes que evoluíram paralelamente. Após a expressão das Ferritinas alfa e beta in vitro foi desenvolvido um ensaio para avaliar o potencial de oxidação de cada subunidade (recombinante não digerida vs recombinante digerida pela protéase TEV). Os resultados demonstraram que as Ferritinas recombinantes digeridas (alfa e beta) apresentam um potencial de oxidação significativamente superior relativamente às proteínas recombinantes não digeridas, não apresentando no entanto quaisquer diferenças entre as subunidades alfa e beta. Resumindo, este trabalho permitiu caracterizar pela primeira vez as sequências completas de dois transcritos diferentes de Ferritinas na amêijoa R. decussatus, que codificam para isoformas distintas desta família de proteínas. A estrutura e os principais domínios são extremamente conservados e a análise das suas propriedades biológicas mostrou que não existem diferenças significativas no potencial de oxidação entre as isoformas alfa e beta. A análise das relações filogenéticas destas proteínas com as de outros organismos, moluscos e vertebrados, permitiu obter informação relevante sobre as relações filogenéticas entre as Ferritinas dos vertebrados e dos moluscos.