Biodistribution analysis of striatal and cerebellar administration of modified adeno-associated viral vectors in normal mice

Afonso, Inês Torquato

http://hdl.handle.net/10400.1/15355

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Authors

Afonso, Inês Torquato

Advisor(s)

Nobre, Rui Jorge

Nóbrega, Clévio

Abstract(s)

Os vírus adeno-associados (AAV) têm 25 nm de diâmetro e transportam uma molécula de DNA de cadeia simples. O seu genoma está flanqueado por duas repetições terminais invertidas e codifica para proteínas de replicação, proteínas da cápside e para a proteína AAP. É um vírus cuja replicação depende da co-infeção com outro vírus, como por exemplo o adenovírus ou o herpes simplex vírus, pois não possui a capacidade de se replicar por si só. Até hoje foram descritos 13 serótipos de AAV e não existe na literatura doenças associadas à sua infeção. Os vetores AAV demonstraram ser sistemas de entrega seguros e fiáveis para entrega de transgenes terapêuticos no sistema nervoso central, mas também noutros órgãos e tecidos. O sistema nervoso central possui um caráter imuno privilegiado, uma vez que, está protegido pelas meninges, pela barreira hemato-encefálica e pelo líquido cefalorraquidiano, que em conjunto previnem a passagem de agentes nocivos exógenos, mas também de agentes terapêuticos. É, portanto, urgente encontrar novos métodos para que o transgene terapêutico atinja as células alvo no tratamento ou na cura de doenças neurológicas. O presente estudo pretende investigar as propriedades do novo vetor mosaico AAV1/AAV2 injetado no estriado e nos núcleos profundos do cerebelo (DCN), comparando-o com os serótipos parentais AAV1 e AAV2. Os critérios avaliados foram a biodistribuição do vetor pelo cérebro, as regiões do cérebro que é capaz de transduzir, o tipo de células que infeta e a toxicidade inerente à sua administração. O novo vetor mosaico AAV1/AAV2 é um AAV recombinante que transporta uma cadeia de DNA simples constituído por as repetições terminais repetidas do serótipo AAV2, o gene que codifica para a proteína green flourescent protein (GFP) e pelo promotor do citomegalovírus. A particularidade que diferencia este vetor dos já existentes, é a constituição da sua cápside, uma vez que a mesma é constituída por proteínas da cápside do serótipo AAV1 e do serótipo AAV2, originando-se por isso uma cápside tipo mosaico, daí o nome, vetor mosaico AAV1/AAV2. Ao possuir estes dois serótipos como constituintes da sua cápside, é possível que o vetor mosaico contenha características das cápside dos vetores parentais tais como, a capacidade de transduzir as células neuronais, característica dos AAV1 e ao mesmo tempo seja capaz de reconhecer o recetor de heparina que é comumente conhecido por ser o recetor primário do AAV2. Este recetor é por isso utilizado para o processo de purificação dos vetores recombinantes do AAV2, através de cromatografia por afinidade à heparina. Desta forma, há a possibilidade do vetor mosaico AAV1/AAV2 poder ser purificado pelo mesmo método. O método da tripla transfecção foi utilizado para a produção dos vetores virais. Este consiste na transfecção de uma linha celular de packaging (HEK293) com três plasmídeos: um plasmídeo helper, um plasmídeo com o transgene de interesse e um plasmídeo que codifica para as proteínas da cápside; que, neste caso específico, são dois plasmídeos, um codificante para as proteínas da cápside do serótipo do AAV1 e outro codificante para as proteínas da cápside do serótipo AAV2. Do mesmo, resulta a produção de um novo vetor com aproximadamente 50% de proteínas da cápside do serótipo AAV1 e os restantes 50% do serótipo AAV2. Numa primeira experiência, murganhos C57BL/6 foram injetados no estriado com 3×109 genomas virais (vg) do vetor mosaico AAV1/AAV2 ou com um dos vetores dos serótipos parentais, AAV1 ou AAV2. Numa segunda experiência, os murganhos foram injetados nos núcleos profundos do cerebelo com 5×109 vg do vetor mosaico AAV1/AAV2 ou com os vetores dos serótipos parentais. Um mês após a injeção, os animais foram sacrificados e o cérebro foi separado, um hemisfério para análise molecular e outro dos hemisférios para análise histológica. Os resultados sugerem que o vetor mosaico AAV1/AAV2 tem uma melhor biodistribuição e transdução comparativamente aos vetores dos serótipos parentais, aquando da sua injeção no estriado. No estriado, os vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2 foram capazes de se espalhar desde a região da injeção para a região mais dorsal do cérebro. No cerebelo os vetores distribuíram-se desde os núcleos profundos do cerebelo para todo o cerebelo, assim como para as regiões que o cerebelo recebe e envia projeções. No estriado, o vetor mosaico AAV1/AAV2 foi o que obteve melhores resultados de transdução e biodistribuição, sendo capaz de transduzir o córtex, o estriado, tálamo, os núcleos endopiriformes, núcleos sub-talâmicos e o globus pallidus; enquanto que, aquando a injecção nos núcleos profundos do cerebelo, o vetor do serótipo AAV1 teve melhor transdução e biodistribuição, sendo capaz de transduzir o cerebelo, o tálamo, o mesencéfalo, o núcleo central da amígdala, a medula e a ponte. Tanto no estriado, como nos núcleos produndos do cerebelo não foi possível inferir o tropismo celular dos vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2, pois nenhum co-localizou com os marcadores utilizados, NeuN, GFAP e Iba-1 que marcam respetivamente, os neurónios, astrócitos e microglia. No entanto, é possível verificar a transdução das células de Purkinje por microscopia, uma vez que, a região onde estas se localizam se encontra a expressar GFP. Os testes toxicológicos revelaram que após a administração dos vetores parentais e o vetor mosaico AAV1/AAV2 no estriado, não houve perda de marcador neuronal. Em conclusão, o vetor mosaico AAV1/AAV2 demonstrou ser um vetor seguro, com resultados que indiciam ser um bom candidato para transdução de células do sistema nervoso central. Este foi capaz de manter o tropismo celular do serótipo parental AAV1 e, simultaneamente, ser purificado pelo método de purificação utilizado para o AAV2, i.e. a cromatografia de afinidade à heparina. Aquando da injeção do vetor mosaico AAV1/AAV2 no cerebelo, a biodistribuição parece estar diminuída em relação ao serótipo AAV1, o que levanta a questão quanto ao contributo do serótipo AAV2 para o modo de dispersão do vetor nesta região. No futuro são necessários testes complementares para determinar se a utilização do vetor mosaico AAV1/AAV2 é superior relativamente aos serótipos parentais e ainda determinar a população neuronal especifica traduzida pelo vetor de interesse. Seria muito interessante que o vetor AAV1/AAV2 fosse empacotado com um gene terapêutico para ser testado, por exemplo, num modelo animal de uma doença neurodegenerativa. Caso os resultados demonstrassem que a utilização do vetor mosaico AAV1/AAV2 fossem vantajosos em relação aos vetores conhecidos, poderia vir a ser utilizado em ensaios clínicos para o tratamento ou cura de doenças neurodegenerativas.

Adeno-associated viral (AAV) vectors have demonstrated to be safe and reliable gene delivery systems to the central nervous system (CNS). Due its immune privileged status, it is difficult to deliver the therapeutical treatment to the target cell and treat neurological disorders of the CNS. This study investigates the spreading, transduction, cell tropism, and toxicity of a novel mosaic AAV, the AAV1/AAV2 delivery system, upon intraparenchymal injection in the striatum and in the deep cerebellar nuclei (DCN) of normal mice. The mosaic AAV1/AAV2 vector was produced using the “triple” transfection method, however, the packing cell was transduced by 2 plasmids encoding for the AAV1 and AAV2 serotype capsid proteins instead of one. The first cohort of C57BL/6 mice was bilaterally injected with 3×109 vg in the striatum with mosaic AAV1/AAV2 or parental serotypes, AAV1 and AAV2. The second cohort was bilaterally injected in the DCN region of the cerebellum with 5×109 vg of mosaic AAV1/AAV2 or parental serotype. The results indicate that in the striatal injection, the mosaic AAV1/AAV2 vector had better spreading and transduce more brain regions than the parental serotypes. The mosaic AAV1/AAV2 and parental vector tropism was unable to be detected with the used antibodies, NeuN, GFAP and Iba-1, which detect neurons, astrocytes, and microglia, respectively, in both striatum and DCN. None of the viral vectors exhibited toxicity in the striatal injection. In the DCN injection, the AAV1 serotype had better spreading and higher transduction levels than the other vectors. In conclusion, the mosaic AAV1/AAV2 is a safe delivery vehicle for CNS with wide transduction results upon intraparenchymal injection. It is capable of sustaining the AAV1 neuronal tropism, as well as to be purified by the AAV2 standard technique, i.e. heparin affinity chromatography. However, further investigation is necessary to increase the sample size and determine the vector cell tropism.