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Publication
Generation of a novel Cockayne syndrome B neuronal culture model from patient-derived induced pluripotent stem cells
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Advisor(s)
Abstract(s)
Cockayne syndrome type B (CSB) is a rare genetic, multisystem disorder, which results from accumulation of DNA damage that arises when the associated gene, ERCC6, is dysfunctional. This leads to premature aging and neurodegeneration. Studies on CSB pathophysiology are lacking, and pre-clinical research of potential therapeutic strategies is nonexistent. Patients with CSB are left without any chance of disease cure or delay, experiencing premature death. Patient-derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) offer a powerful tool to investigate disease mechanisms while generating possibilities for treatment. As a result, our goal was to generate iPSCs from the fibroblasts of CSB patient, as an in vitro model, and differentiate them into neural cell cultures that exhibit CSB-related neuropathological alterations. To achieve this goal, human patient fibroblasts were reprogramed into CSB-iPSCs with the CytoTune iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit. CSB-iPSCs and fibroblasts genetic profile analysis confirmed relatedness between cell lines. The ERCC6 gene was sequenced demonstrating to have the expected mutation, and Western blot analysis further confirmed the presence of a pathogenic mutation. PCR showed that CSB-iPSCs are free of reprograming virus at passage 10 and cultured cells did not contain mycoplasma contamination. Through immunohistochemistry and flow cytometry, CSB-iPSCs demonstrated to express pluripotency markers and capacity to differentiate into the three germ layers. CSB fibroblasts displayed an accumulation of dysfunctional mitochondria, and their DNA repair capacity was affected, upon UV light exposure, as observed through flow cytometry and immunocytochemistry, respectively. This suggests that CSB cells have a dysfunctional transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) and mtDNA repair. CSB-iPSCs were successfully differentiated into neurons and CSB-Neurons appeared to have longer neuronal prolongations that neurons derived from a healthy donor, indicating premature maturation. Our study suggests that the in vitro CSB model generated can help understand this disorder and contribute to the pre-clinical testing of disease-modifying therapies.
As síndromes progeroides humanas são um conjunto de doenças genéticas raras caracterizadas pelo envelhecimento precoce. Embora a compreensão das causas subjacentes a algumas destas doenças tenha sido benéfica no desenvolvimento de terapias, isso não é válido para todas estas condições. A síndrome de Cockayne tipo B (CSB) é uma doença rara, multisistémica, com hereditariedade autossómica recessiva, que resulta do acumular de danos no ADN que surgem quando o gene associado, ERCC6, está disfuncional. Isto acaba por induzir envelhecimento precoce e neurodegeneração. Para além disto, os sintomas desta doença incluem microcefalia pós-natal, atraso severo do crescimento, hipersensibilidade à luz ultravioleta (UV), anormalidades músculo-esqueléticas, deterioração dentário, perda de audição e problemas oculares. No entanto, pneumonia, outras complicações respiratórias e falha renal são as causas mais comuns de morte nestes doentes. Existem três tipos diferentes de síndrome de Cockayne (CS), nomeadamente: (i) tipo I (CS I), a forma clássica, em que os sintomas se manifestam nos primeiros dois anos de vida dos doentes, que têm uma esperança média de vida de 16 anos; (ii) tipo II (CS II), a forma mais severa, com um fenótipo caracterizado por se manifestar antes do nascimento, esperança média de vida muito curta (5/6 anos) e problemas neurológicos severos; e (iii) tipo III (CS III), correspondente a um fenótipo moderado, em que os doentes possuem uma esperança média de vida de 30 anos. Os doentes com mutações no gene ERCC6 normalmente estão mais associados a CS II. Estudos sobre a fisiopatologia de CSB são notavelmente escassos, e investigação pré-clínica de possíveis estratégias terapêuticas é virtualmente inexistente. Os doentes com CSB ficam, assim, sem qualquer hipótese de cura ou atraso da doença, sofrendo uma morte prematura entre os 5 e os 30 anos.
As síndromes progeroides humanas são um conjunto de doenças genéticas raras caracterizadas pelo envelhecimento precoce. Embora a compreensão das causas subjacentes a algumas destas doenças tenha sido benéfica no desenvolvimento de terapias, isso não é válido para todas estas condições. A síndrome de Cockayne tipo B (CSB) é uma doença rara, multisistémica, com hereditariedade autossómica recessiva, que resulta do acumular de danos no ADN que surgem quando o gene associado, ERCC6, está disfuncional. Isto acaba por induzir envelhecimento precoce e neurodegeneração. Para além disto, os sintomas desta doença incluem microcefalia pós-natal, atraso severo do crescimento, hipersensibilidade à luz ultravioleta (UV), anormalidades músculo-esqueléticas, deterioração dentário, perda de audição e problemas oculares. No entanto, pneumonia, outras complicações respiratórias e falha renal são as causas mais comuns de morte nestes doentes. Existem três tipos diferentes de síndrome de Cockayne (CS), nomeadamente: (i) tipo I (CS I), a forma clássica, em que os sintomas se manifestam nos primeiros dois anos de vida dos doentes, que têm uma esperança média de vida de 16 anos; (ii) tipo II (CS II), a forma mais severa, com um fenótipo caracterizado por se manifestar antes do nascimento, esperança média de vida muito curta (5/6 anos) e problemas neurológicos severos; e (iii) tipo III (CS III), correspondente a um fenótipo moderado, em que os doentes possuem uma esperança média de vida de 30 anos. Os doentes com mutações no gene ERCC6 normalmente estão mais associados a CS II. Estudos sobre a fisiopatologia de CSB são notavelmente escassos, e investigação pré-clínica de possíveis estratégias terapêuticas é virtualmente inexistente. Os doentes com CSB ficam, assim, sem qualquer hipótese de cura ou atraso da doença, sofrendo uma morte prematura entre os 5 e os 30 anos.
Description
Keywords
Síndrome de cockayne tipo b (csb) Síndromes progeroides Dano no adn Envelhecimento prematuro Neurodegeneração Células estaminais pluripotentes induzidas (ipscs) Culturas neuronais Modelo de csb