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Interactions of bacteroides dorei with intestinal epithilial cells
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Advisor(s)
Abstract(s)
Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease characterized by the destruction of pancreatic beta cells, leading to insufficient insulin production. Intestinal dysbiosis, (unbalanced microbiota composition), has been associated with T1D.
High population levels of bacteria belonging to the phylum Bacteroidetes have been reported in children with T1D, in contrast to healthy children. The intestinal metaproteome of children with T1D from the Algarve region has shown to be enriched with proteins originating from Bacteroides spp., including B. dorei and B. uniformis. Faecal analyzes allowed the isolation of these species from T1D and Control children of Algarve.
The main goal of the current study was to evaluate the interactions between Bacteroides spp. isolates, including B. dorei, and the intestinal epithelial cells HT29-MTX-E12.
All tested Bacteroides spp. were able to adhere to HT-29-MTX-E12 cells, ranging from 75.43 ± 2.98% to 83.06 ± 1.29%. B. dorei strains were able to invade HT-29-MTX-E12 ranging from 70.11 ± 5.66% to 85.25 ± 5.42%. In contrast, the strains of B. uniformis were not able to invade. Parabacteroides distasonis PtF D14MH1 showed the highest invasion ability (97.38 ± 1.62%). Disruption of the tight junctions of HT29-MTX-E12 cells was evident after exposure to B. dorei and P. distasonis isolates in contrast to slightly impaired after exposure to B. uniformis isolates. The viability of HT29-MTX-E12 cells decreased after exposure to the bacterial supernatant, and it was most evident when the medium was supplemented with 25 and 50% (v/v) of bacterial supernatant. The invasive ability of Bacteroides spp. significantly decreases in the presence of Lactobacillus casei DSM 20011. Cytokine production by HT29-MTX-E12 cells exposed to Bacteroides spp. was not noticeable and only induced the production of IL-8 and MIP-1β.
The damage caused by Bacteroides spp. to the intestinal epithelial cells (disruption of cell junctions, decreased cell viability, adherence and invasive ability of the isolates) may contribute to dysbiosis in children with T1D.
A diabetes é uma doença crónica caracterizada pela deficiência na produção ou ineficiente uso da insulina produzida pelo pâncreas. Essa deficiência na produção de insulina a longo prazo irá provocar um desequilíbrio no metabolismo da glicose. Os sintomas clássicos da doença são a poliúria, polidipsia e polifagia. Se o diagnóstico e / ou o tratamento da doença for tardio, inúmeras complicações graves e crónicas poderão surgir. Existem 3 tipos de diabetes mellitus, confirmados, a diabetes mellitus gestacional, a diabetes mellitus tipo 1 e a diabetes mellitus tipo 2. A diabetes mellitus tipo 1 (DT1) também conhecida como diabetes insulino-dependente, é uma doença autoimune, caracterizada pela destruição das células beta dos ilhéus pancreáticos, efetuada pelas células T. Só quando 90% das células beta pancreáticas são destruídas é que tem inicio a manifestação da doença. Alterações na microbiota intestinal (disbiose) têm sido referidas quer em crianças no período antecedente ao desenvolvimento da autoimunidade, quer em crianças com DT1 estabelecida. A microbiota intestinal das crianças com DT1 tem despertado muito interesse não só devido ao aumento de casos em crianças cada vez mais novas, mas também devido ao aumento de relatos sobre a associação entre a doença e a microbiota do trato gastrointestinal que manifesta um desequilíbrio na sua composição (disbiose). Uma disbisose pode resultar no aparecimento de respostas inflamatórias associadas a diferentes patologias como a síndrome do intestino inflamado ou cancro coloretal. Uma maior abundância de bactérias pertencentes ao Filo Bacteroidetes quer em crianças em seroconversão, quer em crianças com DT1 estabelecida, em contraste com crianças saudáveis que são portadoras de uma maior população de bactérias pertencentes ao Filo Firmicutes tem sido reportada. Um estudo metabólico sobre a microbiota intestinal de crianças diagnosticadas com DT1 e crianças controlo da região do Algarve revelou que crianças diagnosticadas com DT1 apresentam um proteoma mais abundante em proteínas com origem em Bacteroides spp., incluindo B. dorei e B. uniformis, quando comparados com o proteoma de crianças controlo. Uma análise fecal a crianças DT1 e controlo, também do Algarve, permitiu o isolamento de Bacteroides spp. de ambos os grupos de crianças, diferenças na recuperação de algumas espécies de Bacteroides. Bacteroides são bactérias Gram negativas, anaeróbias, mutualiastas que colonizam, em quantidades significativas, o intestino humano. Este género é de extrema importância para a nutrição humana, pois possuem uma grande capacidade de degradação de hidratos de carbono provenientes das plantas e uma das principais fontes de energia provém da fermentação de uma grande variedade de açúcares, estando também associadas ao mecanismo de degradação de mucinas (constituintes do muco que reveste o trato gastrointestinal humano). Pouco se sabe sobre as interações de bactérias, como B. dorei e B. uniformis, com as células epiteliais intestinais. A ligação de Bacteroides à DT1 tem vindo a ser cada vez mais explorada, assim como a sua ligação, se existir, com doenças associadas à DT1. Por conseguinte é de todo o interesse estudar as interações de Bacteroides spp. com o hospedeiro. O principal objetivo deste estudo foi avaiar a capacidade de estirpes de B. dorei, B. uniformis e Parabacteroides distasonis de interagir com células epiteliais intestinais, nameadamente HT29-MTX-E12. Para atingir este objetivo foram estabelecidos os seguintes objetivos específicos: 1) Avaliar a capacidade de adesão e invasão das estirpes de B. dorei (DSM 17855, PtF D1P5, PtF D8M1, PtF D16P1, PtF D16M14, PtF Sb6, PtF Sb8, PtF C1P2), B. uniformis (PtF Sb3P5 e PtF D3Pch2) e P. distasonis PtF D14MH1. 2) Examinar o efeito da exposição das células HT29-MTX-E12 aos diferentes isolados nas ligações celulares. 3) Determinar a viabilidade das linha celular após exposição ao metaboloma bacteriano. 4) Avaliar a indução de uma resposta inflamatória após a exposição da linha celular às células bacterianas. A linha celular HT29-MTX foi isolada da linha HT-29 (diferenciação é irreversível) devido à resistência das células a altas concentrações de metatrexato (MTX) após adaptação gradual a este fármaco anticancerígeno. Este clone é capaz de diferenciar espontaneamente células produtoras de muco. Têm sido utilizadas como modelo para estudar a adesão celular de bactérias lácticas a células epiteliais intestinais. A linha celular foi cultivada no meio in Dulbecco‟s Modified Eagles Medium High Glucose (Sigma) suplementado com soro fetal bovino inativado (10 %, v/v), amino ácidos (1% , v/v) e os antibióticos penicilina e estreptomicina (1 %, v/v). A incubação da linha celular decorreu a 37ºC numa atmosfera húmida com 5 % (v/v) CO2. A linha celular foi utilizada nos ensaios com 21 dias de diferenciação. A exposição da linha celular aos diferentes isolados decorreu em condições de anaerobiose. O meio de cultura Brain Heart Infusion (Biokar, France) suplementado com hemina (0.1%, v/v) e L-cisteina (Sigma-Aldrich, Madrid) foi utilizado para crescer as diferentes espécies de Bacteroides. A estirpe L. casei DSM 20011 foi cultivada no meio de cultura Man Rogosa and Sharpe (Biokar, France). Os resultados obtidos evidenciaram que todas as espécies de Bacteroides testadas têm capacidade de aderir às células HT-29-MTX-E12, variando de 75,43 ± 2,98 % a 83,06 ± 1,29 %. Os isolados de B. dorei apresentaram diferentes capacidades de invasão das células epiteliais intestinais, variando entre 70,11 ± 5,66 % e 85,25 ± 5,42 %. Em contraste, as estirpes de B. uniformis demonstram não possuir capacidade invasiva para estas células. O isolado que apresentou a maior capacidade invasiva para as células HT29-MTX-E12 foi P.distasonis PtF D14MH1 (97,38 ± 1,62%). A disrupção das tight junctions das células HT29-MTX-E12 foi evidente após a exposição aos isolados de B. dorei e P. distasonis, pelo contrário as células expostas aos isolados de B. uniformis apresentaram um leve dano em comparação com as células controlo. A viabilidade das células HT29-MTX-E12 diminuiu após a exposição ao sobrenadante bacteriano, tendo esta diminuição sido mais evidente quando o meio foi suplementado com 25 e 50 % (v/v) de sobrenadante bacteriano. A capacidade invasiva de Bacteroides spp. diminuiu significativamente na presença de Lactobacillus casei DSM 20011. A produção de citocinas pelas células HT29-MTX-E12 expostas a Bacteroides spp. não foi notável tendo apenas induzido a produção de IL-8 e MIP-1β. Os danos causados pela exposição das células epiteliais intestinais a Bacteroides spp. (aderência e capacidade invasiva dos isolados, rutura das tight junctions e diminuição da viabilidade celular) podem contribuir para a disbiose em crianças com DT1.
A diabetes é uma doença crónica caracterizada pela deficiência na produção ou ineficiente uso da insulina produzida pelo pâncreas. Essa deficiência na produção de insulina a longo prazo irá provocar um desequilíbrio no metabolismo da glicose. Os sintomas clássicos da doença são a poliúria, polidipsia e polifagia. Se o diagnóstico e / ou o tratamento da doença for tardio, inúmeras complicações graves e crónicas poderão surgir. Existem 3 tipos de diabetes mellitus, confirmados, a diabetes mellitus gestacional, a diabetes mellitus tipo 1 e a diabetes mellitus tipo 2. A diabetes mellitus tipo 1 (DT1) também conhecida como diabetes insulino-dependente, é uma doença autoimune, caracterizada pela destruição das células beta dos ilhéus pancreáticos, efetuada pelas células T. Só quando 90% das células beta pancreáticas são destruídas é que tem inicio a manifestação da doença. Alterações na microbiota intestinal (disbiose) têm sido referidas quer em crianças no período antecedente ao desenvolvimento da autoimunidade, quer em crianças com DT1 estabelecida. A microbiota intestinal das crianças com DT1 tem despertado muito interesse não só devido ao aumento de casos em crianças cada vez mais novas, mas também devido ao aumento de relatos sobre a associação entre a doença e a microbiota do trato gastrointestinal que manifesta um desequilíbrio na sua composição (disbiose). Uma disbisose pode resultar no aparecimento de respostas inflamatórias associadas a diferentes patologias como a síndrome do intestino inflamado ou cancro coloretal. Uma maior abundância de bactérias pertencentes ao Filo Bacteroidetes quer em crianças em seroconversão, quer em crianças com DT1 estabelecida, em contraste com crianças saudáveis que são portadoras de uma maior população de bactérias pertencentes ao Filo Firmicutes tem sido reportada. Um estudo metabólico sobre a microbiota intestinal de crianças diagnosticadas com DT1 e crianças controlo da região do Algarve revelou que crianças diagnosticadas com DT1 apresentam um proteoma mais abundante em proteínas com origem em Bacteroides spp., incluindo B. dorei e B. uniformis, quando comparados com o proteoma de crianças controlo. Uma análise fecal a crianças DT1 e controlo, também do Algarve, permitiu o isolamento de Bacteroides spp. de ambos os grupos de crianças, diferenças na recuperação de algumas espécies de Bacteroides. Bacteroides são bactérias Gram negativas, anaeróbias, mutualiastas que colonizam, em quantidades significativas, o intestino humano. Este género é de extrema importância para a nutrição humana, pois possuem uma grande capacidade de degradação de hidratos de carbono provenientes das plantas e uma das principais fontes de energia provém da fermentação de uma grande variedade de açúcares, estando também associadas ao mecanismo de degradação de mucinas (constituintes do muco que reveste o trato gastrointestinal humano). Pouco se sabe sobre as interações de bactérias, como B. dorei e B. uniformis, com as células epiteliais intestinais. A ligação de Bacteroides à DT1 tem vindo a ser cada vez mais explorada, assim como a sua ligação, se existir, com doenças associadas à DT1. Por conseguinte é de todo o interesse estudar as interações de Bacteroides spp. com o hospedeiro. O principal objetivo deste estudo foi avaiar a capacidade de estirpes de B. dorei, B. uniformis e Parabacteroides distasonis de interagir com células epiteliais intestinais, nameadamente HT29-MTX-E12. Para atingir este objetivo foram estabelecidos os seguintes objetivos específicos: 1) Avaliar a capacidade de adesão e invasão das estirpes de B. dorei (DSM 17855, PtF D1P5, PtF D8M1, PtF D16P1, PtF D16M14, PtF Sb6, PtF Sb8, PtF C1P2), B. uniformis (PtF Sb3P5 e PtF D3Pch2) e P. distasonis PtF D14MH1. 2) Examinar o efeito da exposição das células HT29-MTX-E12 aos diferentes isolados nas ligações celulares. 3) Determinar a viabilidade das linha celular após exposição ao metaboloma bacteriano. 4) Avaliar a indução de uma resposta inflamatória após a exposição da linha celular às células bacterianas. A linha celular HT29-MTX foi isolada da linha HT-29 (diferenciação é irreversível) devido à resistência das células a altas concentrações de metatrexato (MTX) após adaptação gradual a este fármaco anticancerígeno. Este clone é capaz de diferenciar espontaneamente células produtoras de muco. Têm sido utilizadas como modelo para estudar a adesão celular de bactérias lácticas a células epiteliais intestinais. A linha celular foi cultivada no meio in Dulbecco‟s Modified Eagles Medium High Glucose (Sigma) suplementado com soro fetal bovino inativado (10 %, v/v), amino ácidos (1% , v/v) e os antibióticos penicilina e estreptomicina (1 %, v/v). A incubação da linha celular decorreu a 37ºC numa atmosfera húmida com 5 % (v/v) CO2. A linha celular foi utilizada nos ensaios com 21 dias de diferenciação. A exposição da linha celular aos diferentes isolados decorreu em condições de anaerobiose. O meio de cultura Brain Heart Infusion (Biokar, France) suplementado com hemina (0.1%, v/v) e L-cisteina (Sigma-Aldrich, Madrid) foi utilizado para crescer as diferentes espécies de Bacteroides. A estirpe L. casei DSM 20011 foi cultivada no meio de cultura Man Rogosa and Sharpe (Biokar, France). Os resultados obtidos evidenciaram que todas as espécies de Bacteroides testadas têm capacidade de aderir às células HT-29-MTX-E12, variando de 75,43 ± 2,98 % a 83,06 ± 1,29 %. Os isolados de B. dorei apresentaram diferentes capacidades de invasão das células epiteliais intestinais, variando entre 70,11 ± 5,66 % e 85,25 ± 5,42 %. Em contraste, as estirpes de B. uniformis demonstram não possuir capacidade invasiva para estas células. O isolado que apresentou a maior capacidade invasiva para as células HT29-MTX-E12 foi P.distasonis PtF D14MH1 (97,38 ± 1,62%). A disrupção das tight junctions das células HT29-MTX-E12 foi evidente após a exposição aos isolados de B. dorei e P. distasonis, pelo contrário as células expostas aos isolados de B. uniformis apresentaram um leve dano em comparação com as células controlo. A viabilidade das células HT29-MTX-E12 diminuiu após a exposição ao sobrenadante bacteriano, tendo esta diminuição sido mais evidente quando o meio foi suplementado com 25 e 50 % (v/v) de sobrenadante bacteriano. A capacidade invasiva de Bacteroides spp. diminuiu significativamente na presença de Lactobacillus casei DSM 20011. A produção de citocinas pelas células HT29-MTX-E12 expostas a Bacteroides spp. não foi notável tendo apenas induzido a produção de IL-8 e MIP-1β. Os danos causados pela exposição das células epiteliais intestinais a Bacteroides spp. (aderência e capacidade invasiva dos isolados, rutura das tight junctions e diminuição da viabilidade celular) podem contribuir para a disbiose em crianças com DT1.
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Diabetes tipo 1 Bacteroides spp. Lactobacillus casei HT29-MTX cells Invasão Junções celulares