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Transcriptional regulation of the overlapping human genes optn and CCDC3
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Authors
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Abstract(s)
Human genes OPTN and CCDC3, encoding respectively for optineurin and coiled-coil domain-containing protein 3, are part of the PDB6 locus, a genetic hotspot strongly associated with Paget's disease of bone (PDB), the second most prevalent metabolic bone disease after osteoporosis. OPTN and CCDC3 genes share a head-to-head configuration and partially overlapping sequences, located on opposite strands of this locus.
We first defined the molecular structure of the two genes based on the in silico identified mRNAs, which included several alternatively spliced transcripts. The task was performed with the aid of bioinformatics tools and online databases, such as expressed sequence tags (ESTs), AceView gene browser and Splign software; as a result, we obtained a comprehensive map of OPTN and CCDC3, emphasizing the size and position of introns and exons of each transcript.
Next, we assessed the activity of CCDC3 and OPTN promoter regions; due to their head-to-head disposition, the two genes share a common regulatory sequence. A putative CCDC3 alternative promoter, located downstream and exclusive for certain CCDC3 transcripts, was identified by analysing the gene structure obtained in silico. The activity of the promoter regions was validated by transient transfecting pGL3 reporter constructs, containing the promoter sequences under analysis, into HEK 293 cells, followed by luciferase assays.
Trans-acting regulatory proteins, e.g. transcription factors (TFs), putatively involved in the regulation of the two genes, were identified in silico by analyzing the promoter sequences through bioinformatics software. The analysis revealed several putative TF binding sites, including for NF-κB, a TF known to play a role in the pathogenesis of PDB. Transient co-transfection of HEK 293 cells with pGL3 reporter constructs and transcription factor NF-κB expression vectors, followed by luciferase assays, have been performed in order to confirm their role as trans-regulators of the target promoters, and to unveil the presence of a possible co-regulation.
Os genes humanos OPTN e CCDC3, que codificam respectivamente para optineurina e coiled-coil domain-containing protein 3, fazem parte do locus PDB6, um hotspot genético fortemente associado à doença óssea de Paget (PDB), a segunda doença óssea metabólica mais prevalente após a osteoporose. Os genes OPTN e CCDC3 compartilham uma configuração frente a frente e sequências parcialmente sobrepostas, localizadas em cadeias opostas desse locus. Primeiro, definimos a estrutura molecular dos dois genes com os mRNAs identificados in silico, que incluíam vários transcritos alternadamente unidos. A tarefa foi realizada com o auxílio de ferramentas de bioinformática e bancos de dados on-line, como tags de sequência expressa (ESTs), navegador de genes AceView e software Splign; como resultado, obtivemos um mapa abrangente de OPTN e CCDC3, enfatizando o tamanho e a posição dos íntrons e exons de cada transcrição. Em seguida, avaliamos a atividade das regiões promotoras de CCDC3 e OPTN; devido à sua disposição frente a frente, os dois genes compartilham uma sequência reguladora comum. Um promotor alternativo de CCDC3, localizado a jusante e exclusivo para certos transcritos de CCDC3, foi identificado através da análise da estrutura genética obtida em silico. A atividade das regiões promotoras foi validada por construções repórteres de transfecção pGL3 transitórias, contendo as seqüências promotoras em análise, em células HEK 293, seguidas por ensaios de luciferase. Proteínas reguladoras de ação trans, p. fatores de transcrição (TFs), potencialmente envolvidos na regulação dos dois genes, foram identificados in silico através da análise das seqüências promotoras através do software de bioinformática. A análise revelou vários locais de ligação a TF, incluindo NF-κB, um TF conhecido por desempenhar um papel na patogênese do PDB. A co-transfecção transitória de células HEK 293 com construções repórter pGL3 e vetores de expressão contendo o TF NF-κB, seguidos de ensaios de luciferase, foram realizados para confirmar seu papel como reguladores trans dos promotores alvo e para revelar a presença de um possível co-regulação.
Os genes humanos OPTN e CCDC3, que codificam respectivamente para optineurina e coiled-coil domain-containing protein 3, fazem parte do locus PDB6, um hotspot genético fortemente associado à doença óssea de Paget (PDB), a segunda doença óssea metabólica mais prevalente após a osteoporose. Os genes OPTN e CCDC3 compartilham uma configuração frente a frente e sequências parcialmente sobrepostas, localizadas em cadeias opostas desse locus. Primeiro, definimos a estrutura molecular dos dois genes com os mRNAs identificados in silico, que incluíam vários transcritos alternadamente unidos. A tarefa foi realizada com o auxílio de ferramentas de bioinformática e bancos de dados on-line, como tags de sequência expressa (ESTs), navegador de genes AceView e software Splign; como resultado, obtivemos um mapa abrangente de OPTN e CCDC3, enfatizando o tamanho e a posição dos íntrons e exons de cada transcrição. Em seguida, avaliamos a atividade das regiões promotoras de CCDC3 e OPTN; devido à sua disposição frente a frente, os dois genes compartilham uma sequência reguladora comum. Um promotor alternativo de CCDC3, localizado a jusante e exclusivo para certos transcritos de CCDC3, foi identificado através da análise da estrutura genética obtida em silico. A atividade das regiões promotoras foi validada por construções repórteres de transfecção pGL3 transitórias, contendo as seqüências promotoras em análise, em células HEK 293, seguidas por ensaios de luciferase. Proteínas reguladoras de ação trans, p. fatores de transcrição (TFs), potencialmente envolvidos na regulação dos dois genes, foram identificados in silico através da análise das seqüências promotoras através do software de bioinformática. A análise revelou vários locais de ligação a TF, incluindo NF-κB, um TF conhecido por desempenhar um papel na patogênese do PDB. A co-transfecção transitória de células HEK 293 com construções repórter pGL3 e vetores de expressão contendo o TF NF-κB, seguidos de ensaios de luciferase, foram realizados para confirmar seu papel como reguladores trans dos promotores alvo e para revelar a presença de um possível co-regulação.
Description
Keywords
Gene Expressão Regulação União Promotor TF Luciferase