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Characterization of operons for sucrose metabolism in marine bacteria of the Vibrio genus
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Authors
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Abstract(s)
Some species of the Vibrio genus are within the most frightening pathogenic bacteria to aquaculture and human health and the frequent emergence of novel bacteria strains represents an additional risk. The bacterium Vibrio ichthyoenteri is an important fish pathogen causing high mortality in aquaculture. Recently our group characterized two V. ichthyoenteri isolates (V. ichthyoenteri 1 and 2) and biochemical studies revealed that they have different phenotypes in relation to sucrose metabolism. The aim of this study was to understand the basis of their genetic and phenotypic differences and how this potentially relates with virulence using bioinformatics, microbiology, and molecular approaches. Bioinformatic annotation revealed that V. ichthyoenteri 1 has 4711 genes while V. ichthyoenteri 2 contains 4643 genes and the main differences reside in genes involved in functional/metabolic processes. Characterization of the sucrose operon revealed that two clusters (1A and 1B) exist in V. ichthyoenteri 1 (non-sucrose fermenter strain) while only one operon is present in V. ichthyoenteri 2 (sucrose fermenter strain). Like other bacteria the V. ichthyoenteri sucrose operon is composed of four genes, but sequence comparisons and phylogenetic analysis revealed that V. ichthyoenteri 1A is more like other Vibrios while V. ichthyoenteri 1B and 2 are identical. Gene linkage analysis revealed that V. ichthyoenteri 1A was likely to have acquired extra gene copies by horizontal gene transfer. The presence of sucrose did not modify bacteria growth kinetics but decreased the activity of enzymes that are potentially related with virulence. This was also true for the pathogenic V. harveyi. Gene expression studies targeting the sucrose hydrolysis gene (scrB) revealed that in both strains this gene is expressed in the presence or absence of sucrose and expression increases with culture time suggesting it was probably involved in other metabolic processes. The mechanism responsible for the difference in sucrose utilization between the two strains remains to be further explored.
As bactérias do género Vibrio ganharam notoriedade por serem alguns dos microorganismos patogénicos mais preocupantes em ambientes marinhos. Elas representam ameaças significativas tanto para a aquacultura quanto para as populações humanas. A incidência de surtos de vibriose está em ascensão, e o surgimento de novas estirpes de Vibrio agrava ainda mais os riscos que elas representam. Portanto, é imperativo obter uma compreensão profunda do comportamento das espécies de Vibrio, das bases genéticas, do potencial patogénico e dos riscos de infeção associados. As espécies de Vibrio são motivo de preocupação devido à sua alta abundância, biomassa substancial, taxas de crescimento rápido e capacidade de adaptação a ambientes diversos. Essas características as tornam fontes primárias de doenças infecciosas em ambientes aquáticos. Entre essas espécies, V. harveyi, V. vulnificus, V. alginolyticus e V. parahaemolyticus estão comumente associadas a surtos de vibriose, causando perdas econômicas significativas na indústria da aquacultura. Além disso, 12 espécies de Vibrio são reconhecidas como patógenos humanos, com destaque para V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus. A exposição humana ao Vibrio geralmente ocorre por meio de água contaminada, consumo de frutos do mar crus ou mal cozidos ou contato de ferimentos com águas contaminadas. Além disso, as mudanças climáticas servem como uma variável adicional que afeta o comportamento, prevalência e virulência de patógenos marinhos. Projeções de modelos climáticos indicam um aumento esperado de temperatura de 2,5 a 10 °C no próximo século, uma mudança que pode proporcionar condições favoráveis para o aumento do crescimento de estirpes patogénicas de Vibrio. Este estudo teve como objetivo identificar e caracterizar dois isolados de estirpes de V. ichthyoenteri encontrados na água dos tanques de solha senegalesa (Solea senegalensis) cultivada em instalações internas de Sistema de Aquacultura em Recirculação (RAS). O ponto de partida para esta extensa exploração foi uma descoberta notável durante a nossa pesquisa. Enquanto trabalhava com ágar Thiosulfate-Citrate-Bile Salts-Sucrose (TCBS) e utilizando uma estirpe de V. ichthyoentri gentilmente cedida pelo Dr. Manuel Manchado (Puerto de Santa Maria, Cádiz, Espanha), que foi obtida na água dos tanques de solha senegalesa (Solea senegalensis), a nossa equipa fez uma observação extraordinária. Em vez 10 de observar uma única cor uniforme na placa de ágar TCBS, identificaram dois fenótipos distintos. Um deles apresentava fermentação de sacarose, enquanto o outro não apresentava. Essa diferença na utilização de sacarose tornou-se a força motriz por trás da nossa jornada científica para descobrir as razões genômicas e moleculares subjacentes para essa divergência intrigante, a fim de compreender o seu comportamento. O processo começou com a separação cuidadosa e o cultivo dessas estirpes, e posteriormente foram submetidas a sequenciação para obter uma compreensão mais profunda dos fatores que contribuem para esses fenótipos distintos. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma análise comparativa abrangente entre as duas estirpes de V. ichthyoentri, com foco particular em seus operões de sacarose em comparação com os de outras espécies de Vibrio. A abordagem investigativa combina ferramentas de bioinformática com ensaios microbiológicos, bioquímicos e moleculares para investigar os aspectos complexos da utilização de sacarose e a análise filogenética. Ferramentas de bioinformática foram inicialmente utilizadas para anotar com precisão os genomas das duas estirpes de V.ichthyoenteri. Utilizando a ferramenta RAST, foi realizada uma comparação genômica com a estirpe de referência V. ichthyoenteri (ATCC 700023), revelando uma significativa semelhança na maioria das regiões genômicas. Essa semelhança reforça a sua classificação como V. ichthyoenteri; no entanto, as diferenças observadas no conteúdo genômico as distinguem como novas estirpes dentro desta espécie. A anotação da ferramenta RAST também revelou diferenças no número de genes entre as duas estirpes, sendo que V. ichthyoenteri 1 possui 4711 genes, enquanto V. ichthyoenteri 2 possui 4643 genes, e as principais diferenças residem nos genes relacionados a processos funcionais/metabólicos. De forma significativa, a pesquisa concentrou-se no operão de sacarose, que normalmente consiste em um conjunto de quatro genes responsáveis pela utilização da sacarose. Esses genes incluem o gene para o sistema de transporte de sacarose (scrA), um gene que codifica a sacarase (scrB), o gene da fructoquinase (scrK) e o gene codificador do regulador (scrR). No caso de V. ichthyoenteri 1 (estirpe não fermentadora de sacarose), a investigação revelou a presença de dois operões de sacarose (1A e 1B), enquanto V. ichthyoenteri 2 (estirpe fermentadora de sacarose) possuía apenas um operão. Esse achado destaca uma diferença notável na organização genômica dos operões de sacarose dessas duas estirpes. A análise filogenética revelou que V. ichthyoenteri 1A se assemelha mais a outros Vibrios, enquanto V. ichthyoenteri 1B e 2 são idênticos, sugerindo trajetórias evolutivas 11 divergentes entre eles. Além disso, ao examinar a similaridade de sequência dos genes do operão de sacarose usando o recurso de relatório estatístico do programa GeneDoc, foram observadas diferenças significativas: V. ichthyoenteri 1A exibiu um grau maior de similaridade com genes ortólogos encontrados em V. kanaloae em comparação com V. ichthyoenteri 2. Isso implica uma semelhança genética entre V. ichthyoenteri 1A e V. kanaloae no que diz respeito aos genes do operão de sacarose. Por outro lado, os genes de V. ichthyoenteri 1B foram encontrados como idênticos (100% de similaridade) aos presentes em V. ichthyoenteri 2, fornecendo apoio adicional para as conclusões da árvore filogenética. A análise de ligação gênica também indicou a presença de clusters de genes relacionados ao Plasmídeo F nas proximidades do locus do operão de sacarose de V. ichthyoenteri 1A, sugerindo a possibilidade de eventos de transferência horizontal de genes (HGT). Posteriormente, foram realizados ensaios microbiológicos para explorar a cinética de crescimento das duas estirpes de V. ichthyoenteri na presença e ausência de sacarose. Para este propósito, foram preparadas três composições de meios diferentes: a) TSB/1% NaCl, b) Peptona/1% NaCl e c) Peptona/1% NaCl/1% de Sacarose. Ambas as estirpes foram colocadas em microplacas com diferentes meios e, utilizando um leitor de microplacas a uma temperatura de 24-26°C, a densidade ótica (DO) a 600nm foi registrada a cada hora por aproximadamente 24 horas. Ambas as estirpes apresentaram crescimento muito semelhante no meio TSB/1% NaCl. Por outro lado, a presença de sacarose no meio de cultura contendo apenas Peptona/1% NaCl parece não influenciar o crescimento de ambas as bactérias, mas a sacarose provavelmente é metabolizada por V. ichthyoenteri 2, conforme evidenciado por mudanças na cor nos ensaios com TCBS e vermelho fenol. Foram realizados ensaios de atividade de esterases e proteases em condições específicas, incluindo TSA/1% NaCl a um pH de 7,3 ± 0,2 e uma temperatura de 22°C. Esses ensaios foram conduzidos tanto na presença quanto na ausência de 1% de sacarose, e o período de incubação durou 48 horas. Os resultados revelaram que a presença de sacarose levou a uma redução na atividade de enzimas que podem estar relacionadas à virulência. Finalmente, técnicas de biologia molecular, particularmente a análise de PCR do gene de utilização da sacarose (scrB), foram empregadas para investigar as mudanças na expressão gênica em resposta à presença ou ausência de sacarose. Os resultados indicaram que esse gene é expresso em ambas as estirpes, independentemente da presença de sacarose, com aumento da expressão ao longo do tempo. 12 No entanto, o mecanismo preciso responsável pela diferença na utilização de sacarose entre as duas estirpes ainda precisa ser explorado mais a fundo.
As bactérias do género Vibrio ganharam notoriedade por serem alguns dos microorganismos patogénicos mais preocupantes em ambientes marinhos. Elas representam ameaças significativas tanto para a aquacultura quanto para as populações humanas. A incidência de surtos de vibriose está em ascensão, e o surgimento de novas estirpes de Vibrio agrava ainda mais os riscos que elas representam. Portanto, é imperativo obter uma compreensão profunda do comportamento das espécies de Vibrio, das bases genéticas, do potencial patogénico e dos riscos de infeção associados. As espécies de Vibrio são motivo de preocupação devido à sua alta abundância, biomassa substancial, taxas de crescimento rápido e capacidade de adaptação a ambientes diversos. Essas características as tornam fontes primárias de doenças infecciosas em ambientes aquáticos. Entre essas espécies, V. harveyi, V. vulnificus, V. alginolyticus e V. parahaemolyticus estão comumente associadas a surtos de vibriose, causando perdas econômicas significativas na indústria da aquacultura. Além disso, 12 espécies de Vibrio são reconhecidas como patógenos humanos, com destaque para V. alginolyticus, V. cholerae, V. parahaemolyticus e V. vulnificus. A exposição humana ao Vibrio geralmente ocorre por meio de água contaminada, consumo de frutos do mar crus ou mal cozidos ou contato de ferimentos com águas contaminadas. Além disso, as mudanças climáticas servem como uma variável adicional que afeta o comportamento, prevalência e virulência de patógenos marinhos. Projeções de modelos climáticos indicam um aumento esperado de temperatura de 2,5 a 10 °C no próximo século, uma mudança que pode proporcionar condições favoráveis para o aumento do crescimento de estirpes patogénicas de Vibrio. Este estudo teve como objetivo identificar e caracterizar dois isolados de estirpes de V. ichthyoenteri encontrados na água dos tanques de solha senegalesa (Solea senegalensis) cultivada em instalações internas de Sistema de Aquacultura em Recirculação (RAS). O ponto de partida para esta extensa exploração foi uma descoberta notável durante a nossa pesquisa. Enquanto trabalhava com ágar Thiosulfate-Citrate-Bile Salts-Sucrose (TCBS) e utilizando uma estirpe de V. ichthyoentri gentilmente cedida pelo Dr. Manuel Manchado (Puerto de Santa Maria, Cádiz, Espanha), que foi obtida na água dos tanques de solha senegalesa (Solea senegalensis), a nossa equipa fez uma observação extraordinária. Em vez 10 de observar uma única cor uniforme na placa de ágar TCBS, identificaram dois fenótipos distintos. Um deles apresentava fermentação de sacarose, enquanto o outro não apresentava. Essa diferença na utilização de sacarose tornou-se a força motriz por trás da nossa jornada científica para descobrir as razões genômicas e moleculares subjacentes para essa divergência intrigante, a fim de compreender o seu comportamento. O processo começou com a separação cuidadosa e o cultivo dessas estirpes, e posteriormente foram submetidas a sequenciação para obter uma compreensão mais profunda dos fatores que contribuem para esses fenótipos distintos. O objetivo principal deste estudo é fornecer uma análise comparativa abrangente entre as duas estirpes de V. ichthyoentri, com foco particular em seus operões de sacarose em comparação com os de outras espécies de Vibrio. A abordagem investigativa combina ferramentas de bioinformática com ensaios microbiológicos, bioquímicos e moleculares para investigar os aspectos complexos da utilização de sacarose e a análise filogenética. Ferramentas de bioinformática foram inicialmente utilizadas para anotar com precisão os genomas das duas estirpes de V.ichthyoenteri. Utilizando a ferramenta RAST, foi realizada uma comparação genômica com a estirpe de referência V. ichthyoenteri (ATCC 700023), revelando uma significativa semelhança na maioria das regiões genômicas. Essa semelhança reforça a sua classificação como V. ichthyoenteri; no entanto, as diferenças observadas no conteúdo genômico as distinguem como novas estirpes dentro desta espécie. A anotação da ferramenta RAST também revelou diferenças no número de genes entre as duas estirpes, sendo que V. ichthyoenteri 1 possui 4711 genes, enquanto V. ichthyoenteri 2 possui 4643 genes, e as principais diferenças residem nos genes relacionados a processos funcionais/metabólicos. De forma significativa, a pesquisa concentrou-se no operão de sacarose, que normalmente consiste em um conjunto de quatro genes responsáveis pela utilização da sacarose. Esses genes incluem o gene para o sistema de transporte de sacarose (scrA), um gene que codifica a sacarase (scrB), o gene da fructoquinase (scrK) e o gene codificador do regulador (scrR). No caso de V. ichthyoenteri 1 (estirpe não fermentadora de sacarose), a investigação revelou a presença de dois operões de sacarose (1A e 1B), enquanto V. ichthyoenteri 2 (estirpe fermentadora de sacarose) possuía apenas um operão. Esse achado destaca uma diferença notável na organização genômica dos operões de sacarose dessas duas estirpes. A análise filogenética revelou que V. ichthyoenteri 1A se assemelha mais a outros Vibrios, enquanto V. ichthyoenteri 1B e 2 são idênticos, sugerindo trajetórias evolutivas 11 divergentes entre eles. Além disso, ao examinar a similaridade de sequência dos genes do operão de sacarose usando o recurso de relatório estatístico do programa GeneDoc, foram observadas diferenças significativas: V. ichthyoenteri 1A exibiu um grau maior de similaridade com genes ortólogos encontrados em V. kanaloae em comparação com V. ichthyoenteri 2. Isso implica uma semelhança genética entre V. ichthyoenteri 1A e V. kanaloae no que diz respeito aos genes do operão de sacarose. Por outro lado, os genes de V. ichthyoenteri 1B foram encontrados como idênticos (100% de similaridade) aos presentes em V. ichthyoenteri 2, fornecendo apoio adicional para as conclusões da árvore filogenética. A análise de ligação gênica também indicou a presença de clusters de genes relacionados ao Plasmídeo F nas proximidades do locus do operão de sacarose de V. ichthyoenteri 1A, sugerindo a possibilidade de eventos de transferência horizontal de genes (HGT). Posteriormente, foram realizados ensaios microbiológicos para explorar a cinética de crescimento das duas estirpes de V. ichthyoenteri na presença e ausência de sacarose. Para este propósito, foram preparadas três composições de meios diferentes: a) TSB/1% NaCl, b) Peptona/1% NaCl e c) Peptona/1% NaCl/1% de Sacarose. Ambas as estirpes foram colocadas em microplacas com diferentes meios e, utilizando um leitor de microplacas a uma temperatura de 24-26°C, a densidade ótica (DO) a 600nm foi registrada a cada hora por aproximadamente 24 horas. Ambas as estirpes apresentaram crescimento muito semelhante no meio TSB/1% NaCl. Por outro lado, a presença de sacarose no meio de cultura contendo apenas Peptona/1% NaCl parece não influenciar o crescimento de ambas as bactérias, mas a sacarose provavelmente é metabolizada por V. ichthyoenteri 2, conforme evidenciado por mudanças na cor nos ensaios com TCBS e vermelho fenol. Foram realizados ensaios de atividade de esterases e proteases em condições específicas, incluindo TSA/1% NaCl a um pH de 7,3 ± 0,2 e uma temperatura de 22°C. Esses ensaios foram conduzidos tanto na presença quanto na ausência de 1% de sacarose, e o período de incubação durou 48 horas. Os resultados revelaram que a presença de sacarose levou a uma redução na atividade de enzimas que podem estar relacionadas à virulência. Finalmente, técnicas de biologia molecular, particularmente a análise de PCR do gene de utilização da sacarose (scrB), foram empregadas para investigar as mudanças na expressão gênica em resposta à presença ou ausência de sacarose. Os resultados indicaram que esse gene é expresso em ambas as estirpes, independentemente da presença de sacarose, com aumento da expressão ao longo do tempo. 12 No entanto, o mecanismo preciso responsável pela diferença na utilização de sacarose entre as duas estirpes ainda precisa ser explorado mais a fundo.
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Vibrio ichthyoenteri Vibriosis Aquaculture Sucrose metabolism Sucrose operon