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Establishment of farmed fish welfare biomarkers; A multiomics approach
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Abstract(s)
The sustainability of the aquaculture industry hinges on its ability to operate in harmony with the environment. To achieve this, it is essential to prioritize the welfare of farmed fish minimizing the stress levels associated with aquaculture practices. In this context, it is imperative to conduct a comprehensive study of fish physiological stress. The stress response in fish is initiated by an elaborate endocrine machinery that culminates in an overall metabolic reprogramming induced by the action of glucocorticoids. It can either increase fitness or induce further changes at the whole animal level and impair welfare. This process is orchestrated through a multilayered cellular program, and thus a multiomics approach can provide a holistic overview of the molecular stress response. Knowledge of the key regulators behind the adaptation mechanisms could provide valuable markers of stress to complement the existing measures. Sparus aurata, one of the most important species in Mediterranean aquaculture, was used in this study. Adult fish were subjected to three challenges: overcrowding, net handling, and hypoxia. The plasma proteome was assessed to verify the effect of the different challenges on the fish immune system and to measure the levels of typical stress indicators, i.e., cortisol, glucose, and lactate. A multiomics approach was employed to characterize the hepatic stress response, as the liver is the central organ in mounting the stress response. Lastly, skin mucus was used to identify stress biomarkers as it is easily collectable, and a mucosal tissue known to respond to stress. This work demonstrated that Sparus aurata can adapt better to high stocking densities than to net handling or hypoxia. The latter two challenges induced stress in hepatocytes and promoted several prosurvival pathways, e.g., autophagy, unfolded protein response, and DNA replication stress. Furthermore, a set of 28 candidate biomarkers was identified in the skin mucus, which could be further validated as labbased welfare indicators. This research provides scientific knowledge that can be used to develop species-specific welfare assessment protocols, promote farmed fish safety, and enhance positive societal outcomes while promoting aquaculture sustainability.
A produção de pescado de aquacultura tem vindo a registar um aumento significativo nas últimas décadas, devido a uma procura crescente para consumo humano, aliada a uma forte diminuição dos stocks de peixe nos oceanos a nível mundial. A aquacultura é atualmente o setor da produção alimentar que regista um crescimento mais acelerado, tendo alcançado em 2020 um valor recorde de 87.5 milhões de toneladas, equivalente a aproximadamente 50% da produção de pescado e de outros produtos derivados do mar, a nível global. No mesmo ano, em Portugal, registou-se uma produção de 17 mil toneladas de peixe de aquacultura, representando um crescimento de 18.6% face ao ano anterior, sendo a dourada (Sparus aurata) uma das três espécies com maior produção. A aquacultura desempenha assim um papel crucial no cumprimento das metas propostas pelas Nações Unidas para um desenvolvimento sustentável (SDG goals) no âmbito da Agenda 2030. No entanto, a crescente intensificação na produção neste setor gera também enormes desafios a nível da sustentabilidade ambiental, económica e social. Atualmente, o bem-estar animal é reconhecido como sendo um fator preponderante para uma produção mais sustentável, assim como para a maior aceitação e valorização do produto ao nível do consumidor. Por outro lado, a preocupação com o bem-estar animal e a execução de medidas visando a sua implementação, tem vindo a ser adoptada nas políticas públicas num número crescente de países. O comprometimento das condições de bem-estar animal traduzem-se normalmente numa maior suscetibilidade a agentes patogéneos e aumento das doenças associadas, para além de um menor crescimento, resultando em perdas económicas significativas para o setor aquícola. A evidência científica de senciência, dor e sofrimento nos peixes desencadeou também um aumento significativo no número de estudos com abordagem ao stress e iniciativas em prol do bem-estar animal em peixes de aquacultura. As condições de cultivo adversas e determinados procedimentos de rotina, como sejam o manuseamento e/ou o transporte, podem desencadear stress nos animais. O stress não é necessariamente prejudicial, estando mesmo demonstrado por diversos estudos que a exposição aguda a situações de stress pode ser benéfica, na medida em que promove uma maior resiliência nos animais. No entanto, a longoprazo, este pode afetar o crescimento, a imunidade, o comportamento, e o bem-estar, podendo mesmo levar à morte nos casos mais extremos. Os peixes têm mecanismos neuroendócrinos específicos para lidar com o desiquilíbrio fisiológico através de uma panóplia de adaptações metabólicas, num processo globalmente designado de “resposta ao stress”. Este mecanismo é iniciado pela ativação do eixo hipotálamopituitária-interrenal (HPI) que induz a produção e libertação de cortisol para a corrente sanguínea, a hormona responsável por ativar posteriormente diversas vias metabólicas em diferentes orgãos, promovendo a adaptação ao stress. O fígado é o orgão central na integração da resposta ao stress, sendo responsável pela biossíntese e distribuição de substratos energéticos, tais como a glucose e o lactato, essenciais ao próprio fígado, músculo e cérebro. Numa exploração aquícola, por forma a avaliar o bem-estar dos peixes, são mais frequentemente utilizados os denominados “indicadores de bem-estar operacionais”, que englobam parâmetros tais como o comportamento, a agressividade, a existência de lesões externas e o nível de oxigénio. Outros indicadores de stress e.g., fisiológicos, estão associados a níveis elevados de cortisol e glucose, para além dos indicadores hematológicos, que incluem níveis elevados de eritrócitos e de hematócrito. Estes parâmetros são, no entanto, utilizados com menor frequência, dado que implicam a colheita de amostras por pessoal especializado e envio de amostras para análise em laboratório. Estes indicadores são designados de “indicadores de bem-estar laboratoriais” e, contrariamente aos anteriores, tendem a ser mais eficazes na prevenção atempada de consequências graves derivadas da exposição prolongada ao stress, evitando assim perdas económicas. Contudo, a fiabilidade do cortisol como indicador de stress tem sido posta em causa, nomeadamente em situações de stress crónico. De facto, os níveis de cortisol regressam a valores basais passadas algumas horas após a exposição ao stress. Por outro lado, a existência de diversos fenótipos comportamentais nos peixes, traduzidos em diferentes formas de lidar com o stress (i.e., coping styles) faz com que a resposta ao cortisol possa ser afetada por outros aspectos não diretamente relacionados com o stress, como sejam os ritmos circadianos, a própria espécie ou o estadio de desenvolvimento. A variabilidade das respostas com base nestes parâmetros fisiológicos levou à necessidade de identificar outro tipo de marcadores moleculares que fossem mais fiáveis e eficazes na avaliação do stress e bem-estar em peixes de aquacultura, complementares aos indicadores já existentes. As ómicas como técnicas analíticas de alto rendimento e elevada resolução, em conjunto com a bioinformática, têm sido amplamente utilizadas na descoberta de biomarcadores associados a inúmeros fenótipos em diversos animais, mas sobretudo em humanos, com especial foco na resposta ao cancro. Nos estudos ligados à aquacultura, estas técnicas têm sido utilizadas com enorme sucesso em abordagens relacionadas com a nutrição, rastreabilidade, reprodução, segurança alimentar e bemestar. Neste trabalho, procedeu-se a uma abordagem “multiómica” visando a integração das técnicas de proteómica, transcriptómica e metabolómica na caracterização da resposta molecular ao stress em diferentes tecidos de dourada, de modo a identificar um conjunto de biomarcadores putativos para diferentes tipos de stress. Para tal, foram estabelecidos três ensaios experimentais com douradas adultas, de uma forma independente: 1) alta densidade, 2) manuseamento repetitivo e 3) hipóxia. Em cada ensaio, testaram-se duas condições de stress (uma de maior intensidade, outra de menor), para além do respetivo grupo controlo. No final de cada ensaio recolheram-se amostras de plasma sanguíneo, fígado e de muco obtido a partir da epiderme. Os capítulos desta dissertação estão organizados de acordo com os diferentes tecidos estudados. O “Chapter 2” incide sobre a análise proteómica baseada em gel (2D-DIGE) do plasma sanguíneo para avaliar o efeito dos diferentes tipos de stress no sistema imunitário de douradas adultas. Esta análise foi realizada em conjunto com a medição dos níveis de cortisol, glucose e lactato no plasma, bem como a avaliação do pH e rigor mortis no tecido do músculo. O “Chapter 3” encontra-se dividido em quatro sub-capítulos, focando na análise multiómica de dourada sujeita a diferentes condições experimentais, com o objetivo de estudar e identificar os diferentes mecanismos moleculares de regulação exercida no fígado em resposta ao stress, a nível do genoma e metaboloma. No “Chapter 3.1” foi avaliado o potencial da técnica metabolómica de espectroscopia de infravermelhos designada de FTIR (Fourier Transformed InfraRed spectroscopy) na obtenção de um perfil espectral de infravermelho específico de peixes submetidos a stress. No “Chapter 3.2”, a técnica 2D-DIGE foi novamente utilizada, desta vez na comparação do proteoma de fígado de peixes sujeitos a stress em relação a uma condição controlo. Paralelamente, foram ainda medidos os níveis de glicogénio no fígado, assim como os níveis de transcritos específicos (através da técnica de reação de polimerase em cadeia em tempo real, RT-PCR) escolhidos com base nas respetivas proteínas diferencialmente acumuladas em resposta ao stress. Nos “Chapters 3.3 e 3.4” foi realizada uma análise multiómica do fígado, integrando os dados de proteómica (labelfree shotgun proteomics), transcriptómica (RNA sequencing) e metabolómica (untargeted LC-MS/MS), recorrendo a diferentes ferramentas de bioinformática. O “Chapter 4” incide sobre a descoberta com base em proteómica “shotgun”, de um conjunto de potenciais biomarcadores de stress no muco de dourada, específicos para cada condição experimental. O poder discriminante e preditivo da resposta ao stress de diferentes proteínas foi avaliado com base em modelos de regressão logística. Esta matriz biológica serviu de base à identificação de biomarcadores minimamente invasivos, por se tratar de uma barreira semipermeável entre a epiderme do organismo e o meio envolvente que faz parte do sistema imunitário inato. O facto de o muco ser um biofluído externo facilita a recolha de amostras diminuindo assim o stress associado ao manuseamento dos peixes. No seu conjunto, este estudo demonstra que a dourada é capaz de se adaptar mais rapidamente a situações de alta densidade (até 45 kg m-3 ), exigindo menos alterações a nível do sistema imunitário e do metabolismo, comparativamente à exposição ao manuseamento repetitivo e a baixas concentrações de oxigénio na água. No que respeita a estas duas últimas condições, a resposta ao stress em dourada aponta para a conservação de energia, sendo esta canalizada para as vias de sinalização típicas de resposta de stress celular (autofagia, endocitose, resposta de stress associada ao retículo endoplasmático e interrupção da replicação do DNA e do ciclo celular), assim como para a síntese de proteínas envolvidas nessas mesmas vias. A nível do sistema imunitário a resposta foi distinta, havendo uma ativação do sistema inato nos peixes expostos a manuseamento repetitivo, nomeadamente do sistema hemostático, e uma imunosupressão nos peixes em condições de hipóxia. Verificou-se, no entanto, uma regulação positiva do metabolismo do ferro, que está associada a respostas anti-inflamatórias, nos peixes expostos aos três tipos de stress, sugerindo um papel importante na regulação da resposta imune e da resposta ao stress. É de salientar ainda a elevada variabilidade de respostas dos indicadores plasmáticos, reforçando assim a necessidade de complementar estes parâmetros com outro tipo de indicadores de stress. Por fim, foram identificadas 28 proteínas a partir do muco da pele, como potenciais biomarcadores específicos para cada tipo de stress. Estes poderão vir a ser validados futuramente como indicadores de bem-estar laboratoriais, promovendo assim uma avaliação precoce do nível de stress em peixes de aquacultura, de uma forma mais eficaz, robusta, fiável e holística, essenciais na prevenção de doenças e promoção de um cultivo sustentável das espécies alvo.
A produção de pescado de aquacultura tem vindo a registar um aumento significativo nas últimas décadas, devido a uma procura crescente para consumo humano, aliada a uma forte diminuição dos stocks de peixe nos oceanos a nível mundial. A aquacultura é atualmente o setor da produção alimentar que regista um crescimento mais acelerado, tendo alcançado em 2020 um valor recorde de 87.5 milhões de toneladas, equivalente a aproximadamente 50% da produção de pescado e de outros produtos derivados do mar, a nível global. No mesmo ano, em Portugal, registou-se uma produção de 17 mil toneladas de peixe de aquacultura, representando um crescimento de 18.6% face ao ano anterior, sendo a dourada (Sparus aurata) uma das três espécies com maior produção. A aquacultura desempenha assim um papel crucial no cumprimento das metas propostas pelas Nações Unidas para um desenvolvimento sustentável (SDG goals) no âmbito da Agenda 2030. No entanto, a crescente intensificação na produção neste setor gera também enormes desafios a nível da sustentabilidade ambiental, económica e social. Atualmente, o bem-estar animal é reconhecido como sendo um fator preponderante para uma produção mais sustentável, assim como para a maior aceitação e valorização do produto ao nível do consumidor. Por outro lado, a preocupação com o bem-estar animal e a execução de medidas visando a sua implementação, tem vindo a ser adoptada nas políticas públicas num número crescente de países. O comprometimento das condições de bem-estar animal traduzem-se normalmente numa maior suscetibilidade a agentes patogéneos e aumento das doenças associadas, para além de um menor crescimento, resultando em perdas económicas significativas para o setor aquícola. A evidência científica de senciência, dor e sofrimento nos peixes desencadeou também um aumento significativo no número de estudos com abordagem ao stress e iniciativas em prol do bem-estar animal em peixes de aquacultura. As condições de cultivo adversas e determinados procedimentos de rotina, como sejam o manuseamento e/ou o transporte, podem desencadear stress nos animais. O stress não é necessariamente prejudicial, estando mesmo demonstrado por diversos estudos que a exposição aguda a situações de stress pode ser benéfica, na medida em que promove uma maior resiliência nos animais. No entanto, a longoprazo, este pode afetar o crescimento, a imunidade, o comportamento, e o bem-estar, podendo mesmo levar à morte nos casos mais extremos. Os peixes têm mecanismos neuroendócrinos específicos para lidar com o desiquilíbrio fisiológico através de uma panóplia de adaptações metabólicas, num processo globalmente designado de “resposta ao stress”. Este mecanismo é iniciado pela ativação do eixo hipotálamopituitária-interrenal (HPI) que induz a produção e libertação de cortisol para a corrente sanguínea, a hormona responsável por ativar posteriormente diversas vias metabólicas em diferentes orgãos, promovendo a adaptação ao stress. O fígado é o orgão central na integração da resposta ao stress, sendo responsável pela biossíntese e distribuição de substratos energéticos, tais como a glucose e o lactato, essenciais ao próprio fígado, músculo e cérebro. Numa exploração aquícola, por forma a avaliar o bem-estar dos peixes, são mais frequentemente utilizados os denominados “indicadores de bem-estar operacionais”, que englobam parâmetros tais como o comportamento, a agressividade, a existência de lesões externas e o nível de oxigénio. Outros indicadores de stress e.g., fisiológicos, estão associados a níveis elevados de cortisol e glucose, para além dos indicadores hematológicos, que incluem níveis elevados de eritrócitos e de hematócrito. Estes parâmetros são, no entanto, utilizados com menor frequência, dado que implicam a colheita de amostras por pessoal especializado e envio de amostras para análise em laboratório. Estes indicadores são designados de “indicadores de bem-estar laboratoriais” e, contrariamente aos anteriores, tendem a ser mais eficazes na prevenção atempada de consequências graves derivadas da exposição prolongada ao stress, evitando assim perdas económicas. Contudo, a fiabilidade do cortisol como indicador de stress tem sido posta em causa, nomeadamente em situações de stress crónico. De facto, os níveis de cortisol regressam a valores basais passadas algumas horas após a exposição ao stress. Por outro lado, a existência de diversos fenótipos comportamentais nos peixes, traduzidos em diferentes formas de lidar com o stress (i.e., coping styles) faz com que a resposta ao cortisol possa ser afetada por outros aspectos não diretamente relacionados com o stress, como sejam os ritmos circadianos, a própria espécie ou o estadio de desenvolvimento. A variabilidade das respostas com base nestes parâmetros fisiológicos levou à necessidade de identificar outro tipo de marcadores moleculares que fossem mais fiáveis e eficazes na avaliação do stress e bem-estar em peixes de aquacultura, complementares aos indicadores já existentes. As ómicas como técnicas analíticas de alto rendimento e elevada resolução, em conjunto com a bioinformática, têm sido amplamente utilizadas na descoberta de biomarcadores associados a inúmeros fenótipos em diversos animais, mas sobretudo em humanos, com especial foco na resposta ao cancro. Nos estudos ligados à aquacultura, estas técnicas têm sido utilizadas com enorme sucesso em abordagens relacionadas com a nutrição, rastreabilidade, reprodução, segurança alimentar e bemestar. Neste trabalho, procedeu-se a uma abordagem “multiómica” visando a integração das técnicas de proteómica, transcriptómica e metabolómica na caracterização da resposta molecular ao stress em diferentes tecidos de dourada, de modo a identificar um conjunto de biomarcadores putativos para diferentes tipos de stress. Para tal, foram estabelecidos três ensaios experimentais com douradas adultas, de uma forma independente: 1) alta densidade, 2) manuseamento repetitivo e 3) hipóxia. Em cada ensaio, testaram-se duas condições de stress (uma de maior intensidade, outra de menor), para além do respetivo grupo controlo. No final de cada ensaio recolheram-se amostras de plasma sanguíneo, fígado e de muco obtido a partir da epiderme. Os capítulos desta dissertação estão organizados de acordo com os diferentes tecidos estudados. O “Chapter 2” incide sobre a análise proteómica baseada em gel (2D-DIGE) do plasma sanguíneo para avaliar o efeito dos diferentes tipos de stress no sistema imunitário de douradas adultas. Esta análise foi realizada em conjunto com a medição dos níveis de cortisol, glucose e lactato no plasma, bem como a avaliação do pH e rigor mortis no tecido do músculo. O “Chapter 3” encontra-se dividido em quatro sub-capítulos, focando na análise multiómica de dourada sujeita a diferentes condições experimentais, com o objetivo de estudar e identificar os diferentes mecanismos moleculares de regulação exercida no fígado em resposta ao stress, a nível do genoma e metaboloma. No “Chapter 3.1” foi avaliado o potencial da técnica metabolómica de espectroscopia de infravermelhos designada de FTIR (Fourier Transformed InfraRed spectroscopy) na obtenção de um perfil espectral de infravermelho específico de peixes submetidos a stress. No “Chapter 3.2”, a técnica 2D-DIGE foi novamente utilizada, desta vez na comparação do proteoma de fígado de peixes sujeitos a stress em relação a uma condição controlo. Paralelamente, foram ainda medidos os níveis de glicogénio no fígado, assim como os níveis de transcritos específicos (através da técnica de reação de polimerase em cadeia em tempo real, RT-PCR) escolhidos com base nas respetivas proteínas diferencialmente acumuladas em resposta ao stress. Nos “Chapters 3.3 e 3.4” foi realizada uma análise multiómica do fígado, integrando os dados de proteómica (labelfree shotgun proteomics), transcriptómica (RNA sequencing) e metabolómica (untargeted LC-MS/MS), recorrendo a diferentes ferramentas de bioinformática. O “Chapter 4” incide sobre a descoberta com base em proteómica “shotgun”, de um conjunto de potenciais biomarcadores de stress no muco de dourada, específicos para cada condição experimental. O poder discriminante e preditivo da resposta ao stress de diferentes proteínas foi avaliado com base em modelos de regressão logística. Esta matriz biológica serviu de base à identificação de biomarcadores minimamente invasivos, por se tratar de uma barreira semipermeável entre a epiderme do organismo e o meio envolvente que faz parte do sistema imunitário inato. O facto de o muco ser um biofluído externo facilita a recolha de amostras diminuindo assim o stress associado ao manuseamento dos peixes. No seu conjunto, este estudo demonstra que a dourada é capaz de se adaptar mais rapidamente a situações de alta densidade (até 45 kg m-3 ), exigindo menos alterações a nível do sistema imunitário e do metabolismo, comparativamente à exposição ao manuseamento repetitivo e a baixas concentrações de oxigénio na água. No que respeita a estas duas últimas condições, a resposta ao stress em dourada aponta para a conservação de energia, sendo esta canalizada para as vias de sinalização típicas de resposta de stress celular (autofagia, endocitose, resposta de stress associada ao retículo endoplasmático e interrupção da replicação do DNA e do ciclo celular), assim como para a síntese de proteínas envolvidas nessas mesmas vias. A nível do sistema imunitário a resposta foi distinta, havendo uma ativação do sistema inato nos peixes expostos a manuseamento repetitivo, nomeadamente do sistema hemostático, e uma imunosupressão nos peixes em condições de hipóxia. Verificou-se, no entanto, uma regulação positiva do metabolismo do ferro, que está associada a respostas anti-inflamatórias, nos peixes expostos aos três tipos de stress, sugerindo um papel importante na regulação da resposta imune e da resposta ao stress. É de salientar ainda a elevada variabilidade de respostas dos indicadores plasmáticos, reforçando assim a necessidade de complementar estes parâmetros com outro tipo de indicadores de stress. Por fim, foram identificadas 28 proteínas a partir do muco da pele, como potenciais biomarcadores específicos para cada tipo de stress. Estes poderão vir a ser validados futuramente como indicadores de bem-estar laboratoriais, promovendo assim uma avaliação precoce do nível de stress em peixes de aquacultura, de uma forma mais eficaz, robusta, fiável e holística, essenciais na prevenção de doenças e promoção de um cultivo sustentável das espécies alvo.
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Keywords
Aquaculture Gilthead seabream Metabolomics Proteomics Stress Transcriptomics