Shaping animal design: the role of Hoxd13 targets in the evolution of vertebrate limbs

Francisco, Miguel Duarte Dias

http://hdl.handle.net/10400.1/18153

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Dissertação Mestrado Miguel Francisco.pdf		2.69 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Francisco, Miguel Duarte Dias

Advisor(s)

Andrade, Raquel

Freitas, Renata

Abstract(s)

Durante este projeto, explorámos novas hipóteses nas áreas de Biologia do Desenvolvimento e Evolução, numa tentativa de explicar a transição anatómica que ocorreu entre as barbatanas dos peixes e os membros dos tetrápodes. Este processo envolveu uma redução da área dérmica das barbatanas (“finfold”), bem como uma expansão das estruturas ósseas distais. Assim, a nossa hipótese propõe que genes envolvidos na rede Hoxd13, que são conhecidos por estar envolvidos no processo de formação dos membros, sofreram um processo de aumento de expressão durante a evolução, o que levou a que novas estruturas ósseas fossem progressivamente desenvolvidas na parte distal da barbatana/membro tetrápode. Com este fim, estudámos três linhagens diferentes de peixe-zebra: 1) linha selvagem (wtAB); 2) linha transgénica que sobre expressa hoxd13a (hoxd13 +++) e apresenta “finfolds” mais curtas; e 3) linha mutante que tem uma extensão das “finfolds” (Leot1/Lofdt2). Esta segunda linha possui uma mutação em certos canais de potássio, o que altera o potencial de membrana das células. Esta simples alteração pode levar a uma descompensação de vários processos celulares e genéticos, sendo que não era conhecido que processo levaria a uma expansão da “finfold” nestes peixes. Neste trabalho, analisámos alterações nos níveis de expressão de genes envolvidos na formação da barbatana/membro tetrápode durante o desenvolvimento embrionário por meio de técnicas de RT-qPCR e de hibridização in situ. O nosso principal objetivo foi estudar genes envolvidos na rede Hoxd13, analisando tanto alvos deste gene, como bmp2b, antagonistas dos seus alvos, tais como smoc1, smoc2, noggin3 e gremlin1a e, por último, alvos da própria via de sinalização de BMP’s, nomeadamente os genes msx1b e msx2b. Primeiramente, verificámos que a linha mutante (Leot1/Lofdt2) possui uma “finfold” evidentemente maior do que a condição selvagem durante o desenvolvimento, sendo que esta diferença já é bastante visível em estadios prematuros, a partir de 56 horas pós-fertilização (hpf), e torna-se cada vez mais acentuada com o decorrer do desenvolvimento. Utilizámos marcadores para o gene actinodin1b (and1) que codifica uma proteína não colagénica que faz parte dos raios dérmicos da barbatana. De seguida, analisámos os níveis de bmp2b, bem como os níveis de proliferação, através do gene ciclinb1 (ccnb1), e de apoptose, usando o marcador caspase3 (casp3), sendo que ambos os genes estão envolvidos nos processos que representam. Dados do nosso laboratório já demonstravam que a linha transgénica com “finfolds” mais curtas apresentava uma maior expressão de hoxd13a, bmp2b e casp3, bem como níveis inferiores de ccnb1, quando comparados com a linha selvagem. Contribuímos na avaliação destes mesmos genes na linha mutante, sendo que esta apresenta “finfolds” maiores, relacionados com níveis mais baixos de hoxd13a, bmp2b, casp3 e ccnb1 em relação à condição selvagem. Estes resultados foram publicados em (Castro et al., 2021). Decidimos também analisar outros genes envolvidos nesta rede para ver os seus níveis de expressão e a sua relação com o tamanho do “finfold”. Os nossos resultados sugerem que existem flutuações relevantes dos genes acima mencionados, quer entre linhas estudadas, quer entre diferentes estadios dentro da mesma linha, incluindo a linha selvagem. Assim, contruímos a nossa hipótese de que a modulação das vias de sinalização de BMP’s pode ter sido o mecanismo que levou a uma redução do “finfold” durante a evolução. Esta modulação também deve ter sido importante para controlar a apoptose na “apical ectordermal ridge” (AER) e na formação dos dígitos. Neste processo, estão envolvidos os genes msx1b e msx2b. Encontrámos uma relação entre maiores níveis de expressão de msx2b, o que sugere maior apoptose, e menor “finfold” nas barbatanas das linhas transgénicas e selvagem, enquanto a linha mutante apresenta menos expressão deste gene e maiores “finfolds”. Sugerimos que este processo de controlo de apoptose estava presente no ancestral dos tetrápodes, que mais tarde o redirecionaram para a formação dos dígitos. Outro resultado interessante foi que a sobre expressão de hoxd13a parece aumentar a expressão de vários intervenientes nesta rede, tais como smad1, smoc1, noggin3 e msx2b. Nenhum destes genes está indicado como alvo de hoxd13a (Salsi et al., 2008), o que nos leva a querer que o impacto da expressão de hoxd13a nestes genes se dê de forma indireta. No entanto, já foi proposto que as proteínas Hoxd13 e Smad1 sejam cofatores em membros de ratinho (Williams et al., 2005). Isto pode sugerir que a modulação de apoptose, durante a evolução, pode ter sido devido a esta relação entre estas proteínas, que depois ativam genes de apoptose, como os genes msx. Na linha Leot1/Lofdt2, além das suas barbatanas peitorais mostrarem uma redução na expressão de bmp2b, encontrámos um aumento significativo na expressão de smoc1 e smoc2. Visto que estes são antagonistas de genes bmp, sugerimos que os seus níveis de expressão altos são responsáveis pela redução da expressão de bmp2b, em conjunto com níveis baixos de hoxd13a (Castro et al., 2021). Os antagonistas noggin3 e gremlin1a também apresentaram níveis maiores de expressão nesta linha, podendo contribuir para a redução de bmp2b. Por fim, propomos que este pode não ser o único mecanismo envolvido no fenótipo de maior “finfold” da linha mutante. Ao comparar a expressão dos genes estudados entre estadios na mesma linha, formulámos uma hipótese alternativa; com exceção de smad1, todos os genes relacionados com as vias de sinalização de BMP’s apresentam expressão muito baixa a 24hpf, seguidos de um pico de expressão a 48hpf. Na condição selvagem, este pico aparece mais cedo, às 24hpf. Isto sugere que a rede hoxd13a/bmp não é menos expressa nos mutantes, mas sim retardada no desenvolvimento. Isto pode também explicar o porquê de as barbatanas desta linha parecerem atrasadas no seu desenvolvimento e apresentarem uma morfologia que sugere uma manutenção no estado de proliferação de células na “finfold” durante mais tempo. Os nossos resultados sugerem um novo mecanismo que pode ter levado à redução da área dérmica e expansão dos elementos ósseos distais nas barbatanas de peixes ancestrais, que, posteriormente, evoluíram para membros. Mostrámos que os genes envolvidos na rede Hoxd13 mudam entre as linhas estudadas, mas também, e mais importante, entre os estadios de desenvolvimento. Obtivemos dados que mostram que a linha mutante é retardada no desenvolvimento, com a rede Hoxd13 a iniciar apenas em estadios posteriores. Por outro lado, a condição transgénica é forçada a finalizar essa mesma rede mais cedo do que o suposto, devido ao tratamento de “heat shock”. Isto pode levar a diferentes períodos de tempo em que as células proliferam em vez de se diferenciar, levando a uma “finfold” mais longa ou mais curta na barbatana. Pensamos que este fenómeno de deslocamento temporal pode ter sido o gatilho que levou ao desenvolvimento de estruturas ósseas distais progressivamente mais complexas nas barbatanas, culminando com o autopode característico dos tetrápodes.

During this project, we explored new hypothesis in the fields of Developmental Biology and Evolution, aiming to explain the anatomical transition that occurred between fish fins and tetrapod limbs. This process involved a reduction in the dermal fold of the fins during development (finfold), and concomitant expansion of the distal bone structures. To this end, we used three different strains of zebrafish: 1) wild-type fish (wtAB); 2) transgenic fish that allow overexpression of hoxd13a (hoxd13+++) and, consequently, possess shorter finfolds; and 3) mutant fish which have longer finfolds (Leot1/Lofdt2). We analyzed changes in gene expression levels that may be influenced by hoxd13a expression levels, particularly those associated with BMP signaling, during locomotory appendage formation, using RT-qPCR and in situ hybridization techniques. The results suggest a novel mechanism that may have led to the reduction of finfolds and expansion of distal bone elements in the tetrapod ancestor. We showed that genes associated with BMP signaling are expressed differently in the analyzed zebrafish strains, which are also characterized by distinct levels of hoxd13a expression. Furthermore, the expression dynamics of these genes throughout development were found to be distinct in these lines. We obtained data suggesting that the mutant line is developmentally delayed, having cells that may take longer to enter differentiation, and with hoxd13a-dependent molecular machinery being activated later, compared to wild-type. In contrast, the transgenic condition appears to have the hoxd13a-dependent molecular machinery strongly active after the induction of hoxd13a overexpression. These different timings can lead to distinct periods of cell proliferation followed by differentiation, which can influence the size of the finfolds. Thus, this phenomenon of time-shifting concerning the entry into the differentiation process may have been the trigger that led to shortening of finfolds and expansion of distal bone structures which later evolved to the autopod in tetrapods.