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Sulphated polysaccharides extracted from brine water and its effects on fish immune response
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Abstract(s)
O peixe-zebra (Danio rerio) é um ciprinídeo de água doce nativo da Ásia Meridional. Nestas regiões pode ser encontrado em águas calmas, pouco profundas e com vegetação cujas condições conseguem ser facilmente mimetizadas em tanques com baixo volume. Nestes ambientes o peixe-zebra é capaz de ocupar toda a coluna de água alimentando-se de presas como zooplâncton, insetos, ovos de pequenos crustáceos e, muitas das vezes, algum material inorgânico o que o torna bastante responsivo tanto a alimento vivo, como náuplios de Artémia e rotíferos, como também a dietas inertes, normalmente usadas em contexto laboratorial. A sua reprodução é também facilmente atingida, uma vez que o peixe-zebra consegue desovar numa variedade de condições laboratoriais otimizadas, com o desenvolvimento de técnicas de reprodução através do uso de pequenos tanques, desenhados para promover o comportamento reprodutivo e maximizar o número de ovos.
Para além da facilidade de manutenção, existem mais algumas características que tornam o peixe-zebra um recurso valioso para os cientistas como, por exemplo, o seu tamanho reduzido e o seu rápido desenvolvimento, com um curto período entre gerações que os torna ideais para o planeamento de experiências, e o facto de serem translúcidos durante as primeiras fases de vida facilitando a observação de estruturas internas. Todas estas características contribuem para a sua elevada resistência em várias condições ambientais quando mantidos em cativeiro e são a razão pela qual esta é uma espécie tão bem estudada e utilizada como animal-modelo, com diversas aplicações em diferentes ramos de investigação incluindo biologia de desenvolvimento, ecotoxicologia, neurobiologia, biomedicina e aquacultura.
O peixe-zebra surge também, devido à sua praticabilidade, como complemento em estudos de genética aplicada à imunologia com a possibilidade de detetar fenótipos de interesse já estudados em mamíferos, tais como o rato, que contribuíram para a compreensão do desenvolvimento do sistema imune e de doenças a ele associadas. O uso de mamíferos como animais-modelo vem com a desvantagem de estes terem fertilização interna e não serem translúcidos nas fases larvares tornando impossível o estudo do sistema imune na sua génese, em sistemas in vivo. O ramo da imunologia tem vindo a utilizar o peixe-zebra precisamente devido ao facto de serem translúcidos durante as fases embrionária e larvar. Diversas linhas transgénicas e de sinalização (“reporter lines”) foram desenvolvidas para identificar, mapear, quantificar e compreender a função e interação de diversas células do sistema imune. Exemplos disso são os neutrófilos e macrófagos que, após marcação com um fluorocromo expresso sob controlo de promotores de genes marcadores, tornam possível a análise da sua origem e desenvolvimento em organismos vivos como também uma melhor avaliação dos efeitos de manipulação química e genética relacionadas com a triagem de drogas que possam alterar, ou não, a função destas células.
Outro aspeto importante da imunologia, que tem sido objeto de estudo, passa pela formação inicial de um sistema imune inato e das suas funções durante uma resposta inflamatória induzida. É o sistema imune inato que confere proteção ao peixe-zebra durante as suas primeiras fases de desenvolvimento sem qualquer interferência de uma resposta imune adaptativa que apenas se estabelece entre 4 e 6 semanas após fertilização. Contrastando com os mamíferos e também com os peixes vivíparos, as larvas do peixe-zebra eclodem em contacto direto com o meio ambiente e, como tal, para ultrapassarem a exposição prematura a diversos patógenos, têm de contar com um rápido desenvolvimento do seu sistema imune. De todas as células que desempenham um papel na resposta alérgica e inflamatória em peixes, são os macrófagos e os neutrófilos os mais importantes. Estes dois tipos de leucócitos apesar de estarem presentes às 15 e 48 horas pós-fertilização (hpf), respetivamente, apenas adquirem função às 72 hpf, com os neutrófilos a atuarem em primeiro lugar, seguidos dos macrófagos, que uma vez no local de inflamação fagocitam patógenos e resíduos existentes.
Os neutrófilos vão iniciar a reposta inflamatória recorrendo à fagocitose e à libertação de produtos antimicrobianos e de moléculas sinalizadoras com o objetivo de recrutar outras células imunes. Esta migração/ação dos neutrófilos tornou-se possível de seguir in vivo com a criação de uma linha “reporter” de peixe-zebra através da incorporação da proteína verde fluorescente (Green Fluorescent Protein - GFP) controlada pelo promotor de um gene codificante para uma enzima específica destas células, a mieloperóxidase (Mpx).
Os macrófagos são também constituintes essenciais da resposta imune inata capazes de eliminar bactérias inoculadas, não só da corrente sanguínea, como também de cavidades corporais fechadas mostrando mecanismos de sensibilidade e migração ativos. Tal como para os neutrófilos, foi também desenvolvida uma linha “reporter” para os macrófagos através de um marcador genético específico destas células – macrophage-expressed gene (mpeg) – através da utilização de proteínas com diferentes fluorescências mCherry (Tg(mpeg1:mCherry) e GFP (Tg(mpeg1:EGFP).
A resposta inflamatória começa com o reconhecimento de moléculas e outros patógenos ou de moléculas libertadas por células danificadas. Este reconhecimento é feito por proteínas transmembranares associadas a células do sistema imune inato. Após o reconhecimento, passamos à parte efectora da resposta inflamatória com a ativação de uma cascata molecular que começa com a libertação de citoquinas que recrutam os neutrófilos e os macrófagos já no local, através da sua ação autócrina e parácrina, e que vão também alterar os níveis de citocinas e prostaglandinas na corrente sanguínea, desta vez através da sua ação endócrina. Esta alteração no gradiente das quimiocinas vai, por sua vez, influenciar a migração de leucócitos em direção ao local da inflamação.
A utilização de lipopolissacarídeos bacterianos (LPS) – uma endotoxina existente nas paredes de bactérias Gram-negativas – na indução química da inflamação é um dos modelos mais estudados. É sabido que a estimulação com LPS leva à produção de espécies reativas de oxigénio e de azoto provocadas pelo aumento dos níveis da enzima óxido nítrico-sintase induzida - iNos (Inducible Nitric Oxide Sysnthase). Os níveis da enzima cicloxigenase-2 - Cox-2 (Cyclooxygenase-2) - são também aumentados após estimulação com o LPS. Esta enzima para além de produzir prostaglandinas que promovem a inflamação também dá origem a níveis elevados de RNA mensageiro (mRNA) que codificam pro-citoquinas. O desenvolvimento deste modelo de inflamação criou uma ferramenta para testar e validar diferentes tipos de drogas anti-inflamatórias que podem ir desde drogas bem estudadas na indústria farmacêutica que procuram encontrar novas aplicações, a compostos naturais como extratos de micro- e macroalgas ricos em polifenóis.
Podemos destacar também os polissacarídeos, que tal como outros compostos naturais, têm vindo a ser alvo de estudo com o objetivo de encontrar propriedades bioativas que possam ser aplicadas ao melhoramento da saúde e bem-estar. Os polissacarídeos estão constantemente a serem produzidos por organismos marinhos, fazendo com que a obtenção destes compostos possa ser feita de maneira substancial e sustentável. Estes podem ser classificados de acordo com a sua origem e estrutura, sendo, por exemplo, identificados como ulvanos, aqueles que são obtidos a partir das algas verdes (Chlorophyta) e como fucoidanos, aqueles obtidos a partir de algas castanhas (Phaeophyta).
O nosso interesse foca-se, no entanto, numa classe de polissacarídeos, identificados como polissacarídeos sulfatados, que são descritos na literatura como compostos extremamente bioativos a diferentes níveis, contando com propriedades antibacterianas, antivirais e antioxidantes, como também anticoagulantes, osteogénicas e imuno-estimulantes/imuno-modulatórias. São compostos extremamente solúveis em água e como tal constituem a maior parte dos componentes orgânicos encontrados no material polimérico que está associado ao sal marinho. Estudos realizados com estes compostos extraídos da água de salmoura – um subproduto da cristalização do sal – mostraram que são dotados de propriedades imuno-estimulantes.
Os ensaios realizados in vitro com células SHK-1 sugerem que essas propriedades imuno-estimulantes realmente existem nos polissacarídeos sulfatados estudados. A exposição a estes compostos foi capaz de estimular a expressão de alguns genes relacionados com a resposta imune (tnfα, il-1β e il-8) e com o stress oxidativo (cox-2). A actividade mineralogénica destes compostos também foi avaliada através do ensaio do opérculo em larvas de peixe-zebra. No entanto, não existe qualquer indicação de que estes compostos em específico são dotados de propriedades pro-osteogénicas. Após a inclusão destes compostos em ração comercial, verificou-se que podem influenciar a resposta imune do peixe-zebra após infeção provocada pela bactéria Aeromonas hydrophilla.
Nesta tese, os polissacarídeos sulfatados, originários da água de salmoura, foram estudados de maneira a avaliar a sua bioatividade ao nível da resposta imunitária e da capacidade de modular a mineralização em peixes.
Zebrafish (Danio rerio) is a model animal with increasing applications in several research fields. It arose as a particularly interesting model in the immunology field making possible the study of the immune system at early stages of formation in in vivo systems due to its optical transparency during embryo and larval stages. Apart from that, zebrafish gives the opportunity to study the innate immune system isolated from any kind of adaptive immunity, that will only be established 4 to 6 weeks after fertilization. Neutrophils and macrophages are the principal intervenient cells of the innate immune system. Zebrafish reporter lines with fluorescent proteins, were developed in order to easily recognize, trace and quantify these cells during an inflammatory response. Several approaches to induce inflammation in zebrafish were developed and are described in the literature. The lipopolysaccharides (LPS)-induced inflammation model is one of the most studied, which created an opportunity to test and validate different anti-inflammatory drugs. The operculum assay also arose as a screening method to evaluate compounds with potential mineralogenic effects in zebrafish larvae. Sulphated polysaccharides belong to the most abundant natural compounds produced by living organisms being described as compounds with health improvement and wellbeing effects, such as antibacterial and osteogenic activity and immunomodulatory/ anti-inflammatory properties. In this context, this thesis aims to study the immunostimulant effects of brine derived sulphated polysaccharides on inflammation-induced larvae and juvenile zebrafish and in SHK-1 cells. Also, the mineralogenic effects of these compounds will be accessed in vivo. Overall, survival rates and disease signals will be recorded, and innate immune system mediators and effectors will be measured. Based on the literature, we hypothesise that sulphated polysaccharides may have a positive effect on the inflammatory response, increasing survival rates and reducing inflammation induced damages. We also hypothesise that, based on previous studies performed in zebrafish, the expression of several inflammation modulators and promoters can be decreased by treatment with sulphated polysaccharides, promoting a modulatory effect on inflammation response. The in vitro studies, performed with SHK-1 cell line suggest the existence of immunostimulatory properties in the SP extracts analysed. The cell exposure to these compounds revealed an increment in the expression of genes related to the immune response (tnfα, il-1β and il-8) and oxidative stress (cox-2). The mineralogenic activity was also accessed, under the operculum essay performed in zebrafish larvae, but with no indication of the presence of pro-osteogenic properties. The sulphated polysaccharides studied apparently influence zebrafish immune system response when under a bacterial challenge induced by Aeromonas hydrophilla infection.
Zebrafish (Danio rerio) is a model animal with increasing applications in several research fields. It arose as a particularly interesting model in the immunology field making possible the study of the immune system at early stages of formation in in vivo systems due to its optical transparency during embryo and larval stages. Apart from that, zebrafish gives the opportunity to study the innate immune system isolated from any kind of adaptive immunity, that will only be established 4 to 6 weeks after fertilization. Neutrophils and macrophages are the principal intervenient cells of the innate immune system. Zebrafish reporter lines with fluorescent proteins, were developed in order to easily recognize, trace and quantify these cells during an inflammatory response. Several approaches to induce inflammation in zebrafish were developed and are described in the literature. The lipopolysaccharides (LPS)-induced inflammation model is one of the most studied, which created an opportunity to test and validate different anti-inflammatory drugs. The operculum assay also arose as a screening method to evaluate compounds with potential mineralogenic effects in zebrafish larvae. Sulphated polysaccharides belong to the most abundant natural compounds produced by living organisms being described as compounds with health improvement and wellbeing effects, such as antibacterial and osteogenic activity and immunomodulatory/ anti-inflammatory properties. In this context, this thesis aims to study the immunostimulant effects of brine derived sulphated polysaccharides on inflammation-induced larvae and juvenile zebrafish and in SHK-1 cells. Also, the mineralogenic effects of these compounds will be accessed in vivo. Overall, survival rates and disease signals will be recorded, and innate immune system mediators and effectors will be measured. Based on the literature, we hypothesise that sulphated polysaccharides may have a positive effect on the inflammatory response, increasing survival rates and reducing inflammation induced damages. We also hypothesise that, based on previous studies performed in zebrafish, the expression of several inflammation modulators and promoters can be decreased by treatment with sulphated polysaccharides, promoting a modulatory effect on inflammation response. The in vitro studies, performed with SHK-1 cell line suggest the existence of immunostimulatory properties in the SP extracts analysed. The cell exposure to these compounds revealed an increment in the expression of genes related to the immune response (tnfα, il-1β and il-8) and oxidative stress (cox-2). The mineralogenic activity was also accessed, under the operculum essay performed in zebrafish larvae, but with no indication of the presence of pro-osteogenic properties. The sulphated polysaccharides studied apparently influence zebrafish immune system response when under a bacterial challenge induced by Aeromonas hydrophilla infection.
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Keywords
Danio rerio Sulphated polysaccharides Lipopolysaccharides Aeromonas hydrophila