Loading...
Publication
Study of Matrix Gla Protein (MGP) deficiency in the zebrafish and its interaction with elastin: contribution to the study of Keutel syndrome
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 5.79 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
The Keutel Syndrome (KS) is a rare autosomal recessive disorder that manifests in humans due to loss-of-function mutations in the MATRIX GLA PROTEIN (MGP) gene, which is correlated with ectopic calcification within cartilaginous and vascular tissues. The mechanisms by which MGP inhibits calcium deposition are still poorly understood, thus contributing to a major limitation in the comprehension of the disease pathophysiology and therefore the development of effective therapies. The Mgp-deficient mice model has been very used to favor the understanding of the disease. However, the symptomatology in Mgp-deficient mice is far more severe from what is observed in KS patients, which generates interest in the development of new animal models that can mimic the disease. The objectives of this work were to contribute to the establishment for the first time of a zebrafish model to study KS pathophysiology and to investigate whether MGP is a crucial inhibitor of vascular and cartilage calcification in the zebrafish model. For that, we identified and characterized an mgp zebrafish through RT-PCR and sequencing, and found an 18-nucleotide deletion at exon 4. Next, we performed a morphometric analysis at the larval and adult stages of development, where we found that the homozygous mgp mutant larvae are smaller than their wild-type siblings. To investigate the impact of the mutation in the process of ectopic mineralization, the zebrafish mutants were treated with warfarin, a potent inhibitor of the vitamin K cycle that induces ectopic calcification, and we found that the homozygous mutants die more. To determine the pathological accumulation of calcium, we performed Alizarin red S and von Kossa stainings, and we found that the mgp homozygous mutants have an extensive accumulation of calcium in the abdominal intervertebral space, caudal fin ray area, heart and parasphenoidal carotid artery. To confirm that these effects were due to the loss of expression of Mgp, we performed an immunohistochemistry analysis with an anti-BGP lab produced antibody and found a reduction in the expression of Mgp in the mgp mutants.
In conclusion, we characterized a zebrafish mutant for mgp and found that they have a reduced size and extensive accumulation of calcium in bone and soft tissues. The mgp zebrafish mutant mimics the conditions observed in human KS patients suggesting that it might be a good model to study the pathophysiology of the KS.
A Síndrome de Keutel (KS) foi caracterizada pela primeira vez em 1972 por Keutel e colegas. A (KS) é uma doença autossómica recessiva rara que se manifesta em humanos devido a mutações que levam à perda de função da proteína Gla de Matriz (MGP). A sua prevalência é rara, afetando 1 em 1 000 000 pessoas e, até hoje, apenas 43 casos de KS foram relatados. Contudo, devido às semelhanças sintomáticas com outras doenças e baixa letalidade da KS, espera-se que o número de casos de KS seja maior do que até então tem sido relatado. Apesar da KS ser uma doença rara, possui um quadro de sintomas muito vasto, desde atrasos no desenvolvimento e anormalidades nas estruturas faciais como a hipoplasia da face intermédia, braquitelefalangismo, a sintomas mais severos que condicionam progressivamente a sua saúde, tais como, a calcificação ectópica a nível do trato respiratório, vascular e cartilaginoso. O diagnóstico primordial da KS é frequentemente específico para a sintomatologia e/ou características morfológicas observadas. O braquitelefalangismo e a calcificação coronária da válvula aórtica são frequentemente identificados através de abordagens radiográficas como a tomografia computorizada (TC). As estenoses simples podem ser observadas através da endoscopia e outros sintomas, tais como perda de audição, convulsões ou atraso de desenvolvimento devem ser avaliados muito cedo durante o desenvolvimento, antes que a calcificação anormal inicie nessses tecidos. A esperança média de vida dos pacientes de KS é dependente de muitos fatores, sobretudo a gravidade das complicações associadas ao pulmão, que muitas vezes preveem o prognóstico dos pacientes. No entanto, não existe atualmente nenhuma terapia específica para a KS. A MGP é uma pequena proteína da matriz extracelular (ECM) que tem um papel importante na prevenção da deposição de cálcio e na prevenção de problemas de calcificação ectópica nos tecidos cartilaginosos e vasculares. A MGP pertence à família das proteínas Gla nas quais também estão incluídas outras proteínas esqueléticas da ECM, incluindo a osteocalcina, fatores de coagulação tais como os fatores II, VII, IX e X, e fatores anticoagulantes como as proteínas S e C. A perda de função na MGP leva à calcificação anormal de tecidos moles in vivo, como é observado nos humanos e nos ratinhos. No ratinho, a perda de função da MGP resulta na morte prematura, poucas semanas depois de nascerem, devido a uma extensa calcificação da aorta e consequentemente, a sua ruptura. A MGP desempenha um papel importante na regulação da calcificação da ECM, ligando-se a iões de cálcio com elevada afinidade, evitando assim que estes se acumulem nos locais das fibrilhas de colagénio e elastina. Os mecanismos pelos quais a MGP inibe a deposição do cálcio ainda são pouco compreendidos, contribuindo assim para uma grande limitação na compreensão da patofisiologia da doença e, portanto, no desenvolvimento de terapias eficazes. O modelo de ratinho deficiente da MGP tem sido muito usado para favorecer a compreensão da doença. No entanto, a sintomatologia expressa nos ratos é muito mais grave do que é observado em pacientes com KS. O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno peixe teleósteo de água doce com inúmeras características que o torna num bom modelo de estudo para doenças humanas, tais como o seu rápido desenvolvimento, translucência dos embriões e os baixos requisitos necessários para a sua manutenção. Os peixes-zebra são pequenos, exigindo assim apenas espaço mínimo de manutenção. Os peixes-zebra desenvolvem-se muito rapidamente, em comparação com outros peixes teleósteos e outras espécies de peixes marinhos, permitindo-lhes ser manuseados facilmente para a investigação genética e biomédica, uma vez que podem ser geridos e estudados em fases iniciais do desenvolvimento. Os peixes-zebra têm o seu genoma completamente sequenciado e mapeado, e partilham uma homologia significativa com o genoma humano. A MGP é expressa nos peixes-zebra através de um único gene, e a proteína matura tem 36 aminoácidos totalmente conservados quando comparados com os mamíferos, e dentro destes, estão incluídos os três resíduos Gla que são essenciais para a ativação da proteína. Uma vez que o mutante de ratinho apresenta limitações para o estudo e compreensão da KS, procuramos perceber se o peixe-zebra poderia ser uma boa alternativa para colmatar algumas das suas limitações. Os objetivos deste trabalho delinearam-se em contribuir para o estabelecimento pioneiro de um modelo de peixe-zebra para estudar a patofisiologia da KS e investigar se a MGP é um inibidor crucial da calcificação vascular e cartilagem no modelo do peixe-zebra. A forma mutante da Mgp nos mutantes de peixe-zebra foi identificada e caracterizada através de RT-PCR e sequenciação. Identificámos a mutação como uma deleção de 18 nucleótidos no exão 4 do gene mgp, que prediz uma deleção de 6 aminoácidos na região terminal-C da Mgp. Esta região terminal é altamente conservada entre os vertebrados, e sendo que a mutação ocorreu nesta região, três desses aminoácidos bastante conservados foram removidos. Em seguida, realizámos análises morfométricas nas fases larvares e adultas de desenvolvimento, e observámos que as larvas homozigóticas dos mutantes mgp são mais pequenas do que os seus irmãos wild-type. Para investigar o impacto provocado pela mutação no processo de mineralização ectópica, os peixes-zebra mutantes foram tratados com varfarina, um potente inibidor do ciclo da vitamina K que induz calcificação ectópica e, descobrimos que os mutantes homozigóticos apresentam maior letalidade. Para determinar a acumulação patológica de cálcio, realizámos técnicas específicas de coloração como a de Alizarina vermelha S e von Kossa, e identificámos que os mutantes homozigóticos para o mgp possuem uma extensa acumulação de cálcio no espaço intervertebral abdominal, na área do raio da barbatana caudal, no coração e na artéria carótida adjacente à cartilagem parasfenoidal. Para confirmar que os efeitos observados se deviam à perda de expressão da MGP, realizámos uma análise imunohistoquímica com um anticorpo anti-BGP produzido em laboratório e observámos uma redução na expressão da Mgp nos mutantes homozigóticos para o mgp. Em conclusão, caracterizámos um mutante de peixe-zebra para o mgp e descobrimos que eles têm um tamanho reduzido e acumulação extensiva de cálcio nos tecidos ósseos e moles. O mutante de peixe-zebra mgp imita as condições observadas em pacientes de KS humanos sugerindo que poderia ser um bom modelo para estudar a fisiopatologia do KS.
A Síndrome de Keutel (KS) foi caracterizada pela primeira vez em 1972 por Keutel e colegas. A (KS) é uma doença autossómica recessiva rara que se manifesta em humanos devido a mutações que levam à perda de função da proteína Gla de Matriz (MGP). A sua prevalência é rara, afetando 1 em 1 000 000 pessoas e, até hoje, apenas 43 casos de KS foram relatados. Contudo, devido às semelhanças sintomáticas com outras doenças e baixa letalidade da KS, espera-se que o número de casos de KS seja maior do que até então tem sido relatado. Apesar da KS ser uma doença rara, possui um quadro de sintomas muito vasto, desde atrasos no desenvolvimento e anormalidades nas estruturas faciais como a hipoplasia da face intermédia, braquitelefalangismo, a sintomas mais severos que condicionam progressivamente a sua saúde, tais como, a calcificação ectópica a nível do trato respiratório, vascular e cartilaginoso. O diagnóstico primordial da KS é frequentemente específico para a sintomatologia e/ou características morfológicas observadas. O braquitelefalangismo e a calcificação coronária da válvula aórtica são frequentemente identificados através de abordagens radiográficas como a tomografia computorizada (TC). As estenoses simples podem ser observadas através da endoscopia e outros sintomas, tais como perda de audição, convulsões ou atraso de desenvolvimento devem ser avaliados muito cedo durante o desenvolvimento, antes que a calcificação anormal inicie nessses tecidos. A esperança média de vida dos pacientes de KS é dependente de muitos fatores, sobretudo a gravidade das complicações associadas ao pulmão, que muitas vezes preveem o prognóstico dos pacientes. No entanto, não existe atualmente nenhuma terapia específica para a KS. A MGP é uma pequena proteína da matriz extracelular (ECM) que tem um papel importante na prevenção da deposição de cálcio e na prevenção de problemas de calcificação ectópica nos tecidos cartilaginosos e vasculares. A MGP pertence à família das proteínas Gla nas quais também estão incluídas outras proteínas esqueléticas da ECM, incluindo a osteocalcina, fatores de coagulação tais como os fatores II, VII, IX e X, e fatores anticoagulantes como as proteínas S e C. A perda de função na MGP leva à calcificação anormal de tecidos moles in vivo, como é observado nos humanos e nos ratinhos. No ratinho, a perda de função da MGP resulta na morte prematura, poucas semanas depois de nascerem, devido a uma extensa calcificação da aorta e consequentemente, a sua ruptura. A MGP desempenha um papel importante na regulação da calcificação da ECM, ligando-se a iões de cálcio com elevada afinidade, evitando assim que estes se acumulem nos locais das fibrilhas de colagénio e elastina. Os mecanismos pelos quais a MGP inibe a deposição do cálcio ainda são pouco compreendidos, contribuindo assim para uma grande limitação na compreensão da patofisiologia da doença e, portanto, no desenvolvimento de terapias eficazes. O modelo de ratinho deficiente da MGP tem sido muito usado para favorecer a compreensão da doença. No entanto, a sintomatologia expressa nos ratos é muito mais grave do que é observado em pacientes com KS. O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno peixe teleósteo de água doce com inúmeras características que o torna num bom modelo de estudo para doenças humanas, tais como o seu rápido desenvolvimento, translucência dos embriões e os baixos requisitos necessários para a sua manutenção. Os peixes-zebra são pequenos, exigindo assim apenas espaço mínimo de manutenção. Os peixes-zebra desenvolvem-se muito rapidamente, em comparação com outros peixes teleósteos e outras espécies de peixes marinhos, permitindo-lhes ser manuseados facilmente para a investigação genética e biomédica, uma vez que podem ser geridos e estudados em fases iniciais do desenvolvimento. Os peixes-zebra têm o seu genoma completamente sequenciado e mapeado, e partilham uma homologia significativa com o genoma humano. A MGP é expressa nos peixes-zebra através de um único gene, e a proteína matura tem 36 aminoácidos totalmente conservados quando comparados com os mamíferos, e dentro destes, estão incluídos os três resíduos Gla que são essenciais para a ativação da proteína. Uma vez que o mutante de ratinho apresenta limitações para o estudo e compreensão da KS, procuramos perceber se o peixe-zebra poderia ser uma boa alternativa para colmatar algumas das suas limitações. Os objetivos deste trabalho delinearam-se em contribuir para o estabelecimento pioneiro de um modelo de peixe-zebra para estudar a patofisiologia da KS e investigar se a MGP é um inibidor crucial da calcificação vascular e cartilagem no modelo do peixe-zebra. A forma mutante da Mgp nos mutantes de peixe-zebra foi identificada e caracterizada através de RT-PCR e sequenciação. Identificámos a mutação como uma deleção de 18 nucleótidos no exão 4 do gene mgp, que prediz uma deleção de 6 aminoácidos na região terminal-C da Mgp. Esta região terminal é altamente conservada entre os vertebrados, e sendo que a mutação ocorreu nesta região, três desses aminoácidos bastante conservados foram removidos. Em seguida, realizámos análises morfométricas nas fases larvares e adultas de desenvolvimento, e observámos que as larvas homozigóticas dos mutantes mgp são mais pequenas do que os seus irmãos wild-type. Para investigar o impacto provocado pela mutação no processo de mineralização ectópica, os peixes-zebra mutantes foram tratados com varfarina, um potente inibidor do ciclo da vitamina K que induz calcificação ectópica e, descobrimos que os mutantes homozigóticos apresentam maior letalidade. Para determinar a acumulação patológica de cálcio, realizámos técnicas específicas de coloração como a de Alizarina vermelha S e von Kossa, e identificámos que os mutantes homozigóticos para o mgp possuem uma extensa acumulação de cálcio no espaço intervertebral abdominal, na área do raio da barbatana caudal, no coração e na artéria carótida adjacente à cartilagem parasfenoidal. Para confirmar que os efeitos observados se deviam à perda de expressão da MGP, realizámos uma análise imunohistoquímica com um anticorpo anti-BGP produzido em laboratório e observámos uma redução na expressão da Mgp nos mutantes homozigóticos para o mgp. Em conclusão, caracterizámos um mutante de peixe-zebra para o mgp e descobrimos que eles têm um tamanho reduzido e acumulação extensiva de cálcio nos tecidos ósseos e moles. O mutante de peixe-zebra mgp imita as condições observadas em pacientes de KS humanos sugerindo que poderia ser um bom modelo para estudar a fisiopatologia do KS.
Description
Keywords
Calcificação ectópica Sindrome keutel Peixe-zebra Proteína gla de matriz (mgp)