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Maternal thyroid hormones role in Zebrafish neural development
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Authors
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Abstract(s)
Thyroid hormones (TH) are essential for proper embryonic development of the central
nervous system. During this period maternal supply of TH is the only source of these
hormones to the embryo. Using a zebrafish MCT8 knockdown model, with consequent
inhibition of maternal thyroid hormones (MTH) uptake to the target cells, the aim of this
thesis is to start a comprehensive understanding of the role of MTH during embryonic neural
development. We characterised the transcriptome in 25hpf CTRL and MCT8MO zebrafish
embryos and found 4,343 differentially expressed genes. Reactome analysis show that MTH
regulate the expression of core developmental pathways such as NOTCH, SHH and WNT.
The cellular distribution of neural MTH-target genes demonstrated their cell specific action
on neural stem cells and differentiated neuron classes. We identified a series of genes
involved in several key neurogenic processes to be modulated by MTH. By analysing these
genes by qPCR in a temporal series, from the start of segmentation through hatching, we
determined the developmental time-window where MTH are required for appropriate CNS
development. We show MTH are involved in the regulation of NOTCH pathway
components such as notch1a, dla, dld, her2 and her4 during neurogenesis, whereas
neuroectodermal genes are not affected. Response to MTH begins at 12hpf, and the time
window between 22-25hpf is particularly sensitive to MTH action. Overall, these results,
show that MTH is not involved in neuroectoderm specification nor CNS
compartmentalisation but stress the involvement of MTH in the early stages of neurogenesis
by promoting the maintenance of specific neural progenitor populations. Analyzing the
cytoarchitecture of the spinal cord we found that by the end of embryogenesis cells
populating the spinal cord of control and MCT8 MO zebrafish are substantially different.
Lack of thyroid hormone uptake leads to a generalized disorganization of the neural tissue,
together with a decrease in: neural stem cells population, subpopulations of neuron
progenitor cells, radial glial cells, mature glial cells and oligodendrocyte precursors, while
the primary motor neuron domain was maintained. Colocalization analysis of neural
progenitors with thraa, thrab and mct8 allowed identifying cells under the regulation of
MTH via MCT8. Survival and proliferation of neural progenitor cells are compromised in
MCT8MO, which could later impact on the diversity of neural cell populations obtained in
the end of embryogenesis. Analysis of cell autonomous Notch activation showed it cannot
rescue the phenotype induced by the lack of MTH demonstrating the niche importance in
the regulation of TH action. Given that MTH regulate several important morphogenetic pathways it is likely that its action occurs as an integrator enabling an adequate equilibrium
between all these signals in a time a context dependent manner. MTH actions are reflected
on the timely development of neurons and glial cells. It is of great interest to continue to
explore the significance of these findings to further clarify the genetic and cellular causes
underlying human AHDS syndrome. In conclusion with this work, we show that thyroid
hormone transferred from the mother to the embryo allows the enrichment of neural
progenitor pools and the generation of cell diversity necessary to produce a fully functional central nervous tissue.
As hormonas da tiróide (TH) são essenciais para o correto desenvolvimento embrionário do sistema nervoso central (CNS). Durante este período o fornecimento de hormona da tiróide pela via materna é a única fonte destas hormonas para o embrião, uma vez que a produção endógena desta hormona é iniciada apenas numa fase posterior do desenvolvimento. Evidências mostram que mesmo níveis baixos de deficiência de hormona da tiróide na mãe estão associados a desordens neurológicas e psiquiátricas nos filhos. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ação desta hormona no embrião e feto continuam amplamente desconhecidos. Em humanos, mutações no principal transportador celular de TH, MCT8, causa a síndrome de Herndon-Dudley (AHDS). Esta síndrome é caracterizada pelo atraso mental, atraso global no desenvolvimento, impossibilidade de falar e uma deficiência neuromotora severa. O MCT8 é o principal transportador de hormona da tiróide presente no embrião. No presente trabalho utilizamos o “knockdown” deste transportador, inibindo a sua tradução, no modelo de peixe zebra. Este modelo foi previamente estabelecido e possui características semelhantes à síndrome AHDS humana. Neste modelo o transporte da hormona da tiróide materna (MTH) para as células alvo é bloqueado, uma vez que o MCT8 está ausente, inibindo a ação da hormona. O objetivo desta tese é começar a compreender o papel destas hormonas durante o desenvolvimento neural embrionário. Para isso caracterizamos o transcriptoma de peixe-zebra CTRL e MCT8MO às 25 horas pósfertilização (hpf) por RNA-seq. Foram encontrados 4343 genes diferencialmente expressos. A análise utilizando o Reactome revelou que a MTH está envolvida direta ou indiretamente na expressão de genes pertencentes a importantes vias de sinalização, incluindo Notch, Shh e Wnt. A análise da distribuição celular de genes alvo da MTH por hibridação in-situ revelou uma ação celular específica em células estaminais neurais, mas também sobre várias classes de neurónios diferenciados. A análise transcriptómica revelou também que uma série de genes envolvidos em vários passos de processos-chave da neurogénese são modulados pela MTH. Analisando alguns destes genes numa série temporal desde a fase da segmentação até à eclosão do embrião de peixe-zebra por qPCR, determinamos a janela temporal na qual a MTH é necessária para um correto desenvolvimento do sistema nervoso central no peixezebra. Mostramos que a MTH está envolvida na regulação de componentes da sinalização Notch, tais como notch1a, dla, dld, her2 e her4 durante o processo de neurogénese, enquanto que genes envolvidos na formação e manutenção da neuroectoderme não são regulados pela MTH. A resposta à ausência de MTH inicia-se às 12hpf, sendo que a janela de desenvolvimento entre as 22 e 25hpf parece ser particularmente sensível à ação da MTH. Globalmente estes resultados mostram que a MTH não está envolvida na indução neural, nem na compartimentalização do sistema nervoso central. No entanto é demonstrada a importância da MTH na fase inicial da neurogénese pela promoção da manutenção de populações de células progenitoras neurais. A análise à citoarquitectura da medula espinhal revelou que na fase final do desenvolvimento embrionário as células neurais presentes em embriões CTRLMO e MCT8MO diferem substancialmente. A diminuição de transporte de MTH para as células alvo leva a uma desorganização geral do tecido neural, para além duma redução em células estaminais neurais, subpopulações de células progenitoras de neurónios, células radiais gliais, células da glia maduras e progenitoras de oligodendrócitos; enquanto que a população de neurónios motores primários é mantida na ausência de MTH. Análise de colocalização de células progenitoras neurais her2(+), dla(+) e fabp7a(+) com RNAm de componentes do metabolismo da hormona da tiroide, nomeadamente recetores (thraa e thrab) e o transportador mct8, permitiu a identificação de células que estão sob a regulação da MTH. Um dos papeis clássicos da TH envolve a sobrevivência a proliferação celulares, no entanto a sua função varia com o tipo celular, o estadio de desenvolvimento e contexto celular. Verificámos que em embriões MCT8MO a sobrevivência e proliferação de células progenitoras neurais her2(+) e dla(+) estava comprometida, tanto na medula espinhal como no romboencéfalo. Este facto pode impactar a diversidade das células neurais obtidas no final da embriogénese. Na verdade, a divisão assimétrica de células progenitoras originando células da glia ou progenitoras intermediárias está diminuída nos embriões MCT8MO, mostrando um possível papel da MTH na sua formação. Com vista a esclarecer o papel da MTH sobre a sinalização Notch procedeu-se à ativação da sinalização Notch em células neurais da espinhal medula de embriões MCT8MO e CTRLMO. Esta sobre-expressão celular isolada da sinalização Notch em células individuais mostrou ser insuficiente para recuperar o fenótipo induzido pela falta de MTH, demonstrando a importância do nicho celular na regulação da ação da MTH. A ação da MTH parece estar envolvida no memanismo de divisão assimétrica de células neuroepiteliais. Este tipo de divisão está na origem da diversidade de células neurais obtidas. Um reflexo da perda deste tipo de divisões na espinhal medula pode ser a perda de progenitores intermediários que expressam neurogenina 1 e neurod6b. Dado que a MTH regula várias vias morfogenéticas é provável que a sua ação seja a de integradora entre estas vias, permitindo o equilíbrio entre estes sinais num determinado tempo e contexto celular específicos. As ações da MTH refletem-se no desenvolvimento correto e atempado de neurónios e células da glia. É de grande interesse continuar a explorar o significado destas descobertas, nomeadamente para esclarecer as causas genéticas e celulares que causam a síndrome de Herdnon-Dudley (AHDS). Foi desenvolvido um modelo de ação da MTH durante o desenvolvimento no peixe zebra, em que em subpopulações de células progenitoras contendo MCT8 e recetores da hormona da tiroide (sensíveis a TH) na ausência desta sofrem apoptose e/ou redução na proliferação em momentos distintos do desenvolvimento neural. As células progenitoras não responsivas à TH prosseguem o seu desenvolvimento. O balanço final será uma diminuição da diversidade de progenitores neurais e consequente perda na variedade de neurónios e células da glia maduros. Este efeito a nível celular terá efeito na função do CNS. Em conclusão este trabalho mostra que a hormona da tiroide transmitida da mãe para o embrião e que dá entrada nas células alvo através do MCT8 permite o desenvolvimento de populações de progenitores neurais e o consequente enriquecimento da diversidade celular, necessária à formação de um sistema nervoso central funcional.
As hormonas da tiróide (TH) são essenciais para o correto desenvolvimento embrionário do sistema nervoso central (CNS). Durante este período o fornecimento de hormona da tiróide pela via materna é a única fonte destas hormonas para o embrião, uma vez que a produção endógena desta hormona é iniciada apenas numa fase posterior do desenvolvimento. Evidências mostram que mesmo níveis baixos de deficiência de hormona da tiróide na mãe estão associados a desordens neurológicas e psiquiátricas nos filhos. No entanto os mecanismos moleculares envolvidos na ação desta hormona no embrião e feto continuam amplamente desconhecidos. Em humanos, mutações no principal transportador celular de TH, MCT8, causa a síndrome de Herndon-Dudley (AHDS). Esta síndrome é caracterizada pelo atraso mental, atraso global no desenvolvimento, impossibilidade de falar e uma deficiência neuromotora severa. O MCT8 é o principal transportador de hormona da tiróide presente no embrião. No presente trabalho utilizamos o “knockdown” deste transportador, inibindo a sua tradução, no modelo de peixe zebra. Este modelo foi previamente estabelecido e possui características semelhantes à síndrome AHDS humana. Neste modelo o transporte da hormona da tiróide materna (MTH) para as células alvo é bloqueado, uma vez que o MCT8 está ausente, inibindo a ação da hormona. O objetivo desta tese é começar a compreender o papel destas hormonas durante o desenvolvimento neural embrionário. Para isso caracterizamos o transcriptoma de peixe-zebra CTRL e MCT8MO às 25 horas pósfertilização (hpf) por RNA-seq. Foram encontrados 4343 genes diferencialmente expressos. A análise utilizando o Reactome revelou que a MTH está envolvida direta ou indiretamente na expressão de genes pertencentes a importantes vias de sinalização, incluindo Notch, Shh e Wnt. A análise da distribuição celular de genes alvo da MTH por hibridação in-situ revelou uma ação celular específica em células estaminais neurais, mas também sobre várias classes de neurónios diferenciados. A análise transcriptómica revelou também que uma série de genes envolvidos em vários passos de processos-chave da neurogénese são modulados pela MTH. Analisando alguns destes genes numa série temporal desde a fase da segmentação até à eclosão do embrião de peixe-zebra por qPCR, determinamos a janela temporal na qual a MTH é necessária para um correto desenvolvimento do sistema nervoso central no peixezebra. Mostramos que a MTH está envolvida na regulação de componentes da sinalização Notch, tais como notch1a, dla, dld, her2 e her4 durante o processo de neurogénese, enquanto que genes envolvidos na formação e manutenção da neuroectoderme não são regulados pela MTH. A resposta à ausência de MTH inicia-se às 12hpf, sendo que a janela de desenvolvimento entre as 22 e 25hpf parece ser particularmente sensível à ação da MTH. Globalmente estes resultados mostram que a MTH não está envolvida na indução neural, nem na compartimentalização do sistema nervoso central. No entanto é demonstrada a importância da MTH na fase inicial da neurogénese pela promoção da manutenção de populações de células progenitoras neurais. A análise à citoarquitectura da medula espinhal revelou que na fase final do desenvolvimento embrionário as células neurais presentes em embriões CTRLMO e MCT8MO diferem substancialmente. A diminuição de transporte de MTH para as células alvo leva a uma desorganização geral do tecido neural, para além duma redução em células estaminais neurais, subpopulações de células progenitoras de neurónios, células radiais gliais, células da glia maduras e progenitoras de oligodendrócitos; enquanto que a população de neurónios motores primários é mantida na ausência de MTH. Análise de colocalização de células progenitoras neurais her2(+), dla(+) e fabp7a(+) com RNAm de componentes do metabolismo da hormona da tiroide, nomeadamente recetores (thraa e thrab) e o transportador mct8, permitiu a identificação de células que estão sob a regulação da MTH. Um dos papeis clássicos da TH envolve a sobrevivência a proliferação celulares, no entanto a sua função varia com o tipo celular, o estadio de desenvolvimento e contexto celular. Verificámos que em embriões MCT8MO a sobrevivência e proliferação de células progenitoras neurais her2(+) e dla(+) estava comprometida, tanto na medula espinhal como no romboencéfalo. Este facto pode impactar a diversidade das células neurais obtidas no final da embriogénese. Na verdade, a divisão assimétrica de células progenitoras originando células da glia ou progenitoras intermediárias está diminuída nos embriões MCT8MO, mostrando um possível papel da MTH na sua formação. Com vista a esclarecer o papel da MTH sobre a sinalização Notch procedeu-se à ativação da sinalização Notch em células neurais da espinhal medula de embriões MCT8MO e CTRLMO. Esta sobre-expressão celular isolada da sinalização Notch em células individuais mostrou ser insuficiente para recuperar o fenótipo induzido pela falta de MTH, demonstrando a importância do nicho celular na regulação da ação da MTH. A ação da MTH parece estar envolvida no memanismo de divisão assimétrica de células neuroepiteliais. Este tipo de divisão está na origem da diversidade de células neurais obtidas. Um reflexo da perda deste tipo de divisões na espinhal medula pode ser a perda de progenitores intermediários que expressam neurogenina 1 e neurod6b. Dado que a MTH regula várias vias morfogenéticas é provável que a sua ação seja a de integradora entre estas vias, permitindo o equilíbrio entre estes sinais num determinado tempo e contexto celular específicos. As ações da MTH refletem-se no desenvolvimento correto e atempado de neurónios e células da glia. É de grande interesse continuar a explorar o significado destas descobertas, nomeadamente para esclarecer as causas genéticas e celulares que causam a síndrome de Herdnon-Dudley (AHDS). Foi desenvolvido um modelo de ação da MTH durante o desenvolvimento no peixe zebra, em que em subpopulações de células progenitoras contendo MCT8 e recetores da hormona da tiroide (sensíveis a TH) na ausência desta sofrem apoptose e/ou redução na proliferação em momentos distintos do desenvolvimento neural. As células progenitoras não responsivas à TH prosseguem o seu desenvolvimento. O balanço final será uma diminuição da diversidade de progenitores neurais e consequente perda na variedade de neurónios e células da glia maduros. Este efeito a nível celular terá efeito na função do CNS. Em conclusão este trabalho mostra que a hormona da tiroide transmitida da mãe para o embrião e que dá entrada nas células alvo através do MCT8 permite o desenvolvimento de populações de progenitores neurais e o consequente enriquecimento da diversidade celular, necessária à formação de um sistema nervoso central funcional.
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Keywords
Hormona da tiroide materna:mct8 Peixe-Zebra Desenvolvimento embrionário Neurogénese