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Improvement of senegalese sole sperm quality through the action of melatonin and other natural antioxidants
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Abstract(s)
Nowadays, Senegalese sole industry still depends on wild-caught males to maintain reproduction in captivity, since F1 males do not spawn naturally and present low sperm volume and quality. This thesis intended to improve the sperm quality of F1 breeders using natural antioxidants, with a particular focus on melatonin, a night-hormone that controls reproduction and has a strong antioxidant capacity. First, through radioimmunoassay, it was reported for the first time that melatonin is present in fish seminal plasma, is species-specific and has day/night oscillations likewise in the bloodstream. Moreover, in Senegalese sole, it demonstrated to contribute to seminal antioxidant status, regardless of broodstock origin. The second objective was to find if gonads are an extra-pineal melatonin production site. Through real-time quantitative PCR, it was demonstrated that genes encoding for key enzymes involved in melatonin biosynthesis (tph1a, aanat1a, aanat2, hiomt1) and melatonin receptors (mel1 and mel2) were expressed in Senegalese sole brain, eye and testes, showing daily and seasonal variations, and different patterns according to fish origin. New information regarding the reproductive impairment of F1 males was given by the differences in seasonal blood melatonin levels and the lack of correlation between sex steroids in seminal plasma. The endogenous and exogenous effects of melatonin on sperm quality were also explored, and motility was enhanced by endogenous melatonin production. However, melatonin supplementation in the cryopreservation medium did not confer extra protection to spermatozoa. Nonetheless, promising results were obtained with other natural antioxidants supplemented in the broodstock diets: different algae-supplemented diets, with distinct bioactive compounds, modulated different spermatozoa traits according to the type of algae used and if used singly or combined. Overall, this thesis unravelled melatonin mechanisms in Senegalese sole reproductive system, found that industry could benefit from collecting sperm at night, and that algae-based antioxidants have the potential to improve sperm quality.
Atualmente, a reprodução em cativeiro do linguado senegalês continua a depender da captura de machos selvagens para que a indústria mantenha a sua produção. Tal sucede, pois os machos de primeira geração (F1), nascidos e criados em cativeiro, não libertam os gametas naturalmente e produzem sémen de baixa qualidade e em menor volume em comparação com os machos selvagens. Esta tese teve como principal objetivo a melhoria da qualidade do sémen dos reprodutores F1 através da ação de antioxidantes naturais, tendo como foco a melatonina, uma hormona produzida à noite que controla a reprodução e apresenta uma grande capacidade antioxidante. Inicialmente, realizou-se uma revisão bibliográfica sobre o tema, a qual incluiu categorizar os diferentes antioxidantes utilizados para melhorar a qualidade espermática dos peixes e diferentes metodologias para o fazer, dando especial atenção à melatonina, no que respeita aos seus mecanismos de ação, locais de produção e efeitos no sémen de diversas espécies. Esta tarefa foi reveladora da evidente lacuna ao nível de informação relativamente a estes tópicos e ao sistema reprodutivo dos peixes. Posteriormente, pretendeu-se compreender se a melatonina estaria presente no plasma seminal dos peixes e quais as suas possíveis funções. Para isso, desenhou-se um ensaio com machos selvagens e F1 de linguado senegalês, incluindo também outras espécies com estratégias reprodutivas distintas: robalo (Dicentrarchux labrax) e dourada (Sparus aurata), de forma a conferir maior robustez ao estudo. Através de análises de radioatividade (RIA), adaptou-se a metodologia existente para a quantificação de melatonina em plasma seminal de peixes. Desta forma, pela primeira vez, descobriu-se que a melatonina está presente no plasma seminal dos peixes. Para além disso, verificou--se que a sua presença no plasma seminal é específica de cada espécie e apresenta oscilações dia/noite, tal como sucede na corrente sanguínea. Não obstante, no linguado, a presença de melatonina no plasma seminal demonstrou ter um papel importante no sistema antioxidante deste fluído, independentemente da origem dos reprodutores (selvagens ou F1). O segundo objetivo desta tese consistiu em verificar se as gónadas poderiam ser um local de produção de melatonina extra-pineal. Através de técnicas de PCR quantitativo em tempo real, demonstrou-se que os genes que codificam as enzimas-chave envolvidas na biossíntese da melatonina (tph1a, aanat1a, aanat2, hiomt1) e os seus recetores (mel1 e mel2) se expressam no cérebro, olho e testículo do linguado senegalês, mostrando variações diárias e sazonais, e padrões diferentes de acordo com a origem dos reprodutores. Paralelamente, nos machos F1, as diferenças encontradas nos níveis sazonais de melatonina no sangue e a falta de correlação entre os esteroides sexuais (testosterona e 11-ketotestosterona) no plasma seminal revelaram novas informações sobre a disrupção hormonal do eixo hipotálamo-pituitária-gónada (HPG) nos machos nascidos em cativeiro. Um dos principais objetivos desta tese foi estudar os possíveis efeitos da melatonina endógena e exógena na qualidade do sémen de linguado, de modo a compreender se haveria uma forma não invasiva e sustentável de melhorar a qualidade espermática desta espécie. Assim, desenharam-se dois ensaios de criopreservação distintos, um com dourada e outro com linguado. A criopreservação de sémen é uma técnica muito utilizada em aquacultura e que permite ultrapassar problemas como o da assincronia na obtenção de gametas femininos e masculinos, um problema existente no controle da reprodução do linguado senegalês em cativeiro. Contudo, esta técnica provoca danos celulares que, muitas vezes, comprometem a viabilidade das células após a descongelação. Assim, utilizou-se a melatonina, descrita como um forte agente antioxidante, enquanto suplemento durante a criopreservação de sémen. Com estes ensaios, descobriu-se que a indústria do linguado senegalês poderia beneficiar da recolha de sémen à noite, quando os parâmetros de mobilidade são melhorados pela melatonina produzida naturalmente pelo organismo (endógena). No entanto, a sua suplementação no meio de criopreservação (exógena) não conferiu uma proteção extra aos espermatozoides contra os danos infligidos pelos processos de congelação e descongelação. Contudo, através do recurso à melatonina marcada com fluoresceína e técnicas de microscopia confocal, foi possível observar-se que a melatonina atravessa facilmente a membrana plasmática dos espermatozoides, através de um processo de difusão passiva, espalhando-se pelo núcleo e mitocôndrias. Tal permitiu concluir que o facto de a melatonina não funcionar como um agente antioxidante durante a criopreservação não se devia a falhas técnicas de execução, mas sim a uma eventual inação desta substância provocada pela sua sensibilidade às baixas temperaturas da criopreservação. De forma a explorar o potencial de utilização de outros antioxidantes naturais, nomeadamente antioxidantes provenientes de micro e macroalgas, mas também outras formas de suplementação, desta vez suplementados diretamente na ração dos reprodutores, desenharam-se dois ensaios distintos onde se obtiveram resultados promissores. Em ambos, substituiu-se 6 % da farinha de trigo por 6 % de alga seca aquando da formulação das rações. No primeiro ensaio, com duração de 2 meses, utilizaram-se duas rações experimentais suplementadas com macroalga seca, uma dieta continha Plocamium cartilagineum e a outra Sargassum vulgare. A primeira melhorou a qualidade do sémen, através de uma maior viabilidade e mobilidade dos espermatozoides, enquanto a segunda promoveu o sistema antioxidante das gónadas, com efeitos na capacidade antioxidante do sémen. Num segundo ensaio, formulou-se apenas uma ração com combinação de micro e macroalgas: inclusão de 3 % Phaeodactylum tricornutum e 3 % Gracillaria gracilis, respetivamente. Este ensaio teve a duração de uma época de reprodução, com amostragens quinzenais, de forma a avaliar os efeitos sinérgicos destas algas ao longo do tempo. Porém, a ração combinada não conseguiu diminuir a variabilidade da qualidade do sémen de linguado ao longo da época, mas mostrou-se capaz de diminuir os processos oxidativos e prevenir a fragmentação do DNA em determinados pontos de amostragem. Contudo, os resultados de transcriptómica executados nas gónadas sugerem a existência de um composto não favorável à espermatogénese. Em suma, as diferentes algas, com compostos bioativos distintos, modularam diferentes características dos espermatozoides de acordo com o tipo de algas utilizadas e se utilizadas isoladamente ou combinadas. Numa perspetiva futura, e face aos resultados obtidos nesta tese, a melatonina apresenta aplicabilidade para a indústria quando utilizada de forma natural. No entanto, muito ainda está por descobrir quanto à sua possível aplicação tanto em in vitro como in vivo, nomeadamente se esta hormona poderá ter efeitos na seleção de um parceiro sexual. Tal seria fundamental para a indústria desta espécie, uma vez que os machos F1 de linguado senegalês não apresentam o típico comportamento de corte reprodutiva em cativeiro, o que inviabiliza a reprodução natural desta espécie. Quanto à utilização de dietas suplementadas com algas ricas em antioxidantes, esta tese evidenciou os efeitos benéficos da sua utilização, embora sejam necessários ensaios prolongados e mais investigação sobre o mecanismo de ação dos compostos bioativos das algas para se poder otimizar rações funcionais para a indústria.
Atualmente, a reprodução em cativeiro do linguado senegalês continua a depender da captura de machos selvagens para que a indústria mantenha a sua produção. Tal sucede, pois os machos de primeira geração (F1), nascidos e criados em cativeiro, não libertam os gametas naturalmente e produzem sémen de baixa qualidade e em menor volume em comparação com os machos selvagens. Esta tese teve como principal objetivo a melhoria da qualidade do sémen dos reprodutores F1 através da ação de antioxidantes naturais, tendo como foco a melatonina, uma hormona produzida à noite que controla a reprodução e apresenta uma grande capacidade antioxidante. Inicialmente, realizou-se uma revisão bibliográfica sobre o tema, a qual incluiu categorizar os diferentes antioxidantes utilizados para melhorar a qualidade espermática dos peixes e diferentes metodologias para o fazer, dando especial atenção à melatonina, no que respeita aos seus mecanismos de ação, locais de produção e efeitos no sémen de diversas espécies. Esta tarefa foi reveladora da evidente lacuna ao nível de informação relativamente a estes tópicos e ao sistema reprodutivo dos peixes. Posteriormente, pretendeu-se compreender se a melatonina estaria presente no plasma seminal dos peixes e quais as suas possíveis funções. Para isso, desenhou-se um ensaio com machos selvagens e F1 de linguado senegalês, incluindo também outras espécies com estratégias reprodutivas distintas: robalo (Dicentrarchux labrax) e dourada (Sparus aurata), de forma a conferir maior robustez ao estudo. Através de análises de radioatividade (RIA), adaptou-se a metodologia existente para a quantificação de melatonina em plasma seminal de peixes. Desta forma, pela primeira vez, descobriu-se que a melatonina está presente no plasma seminal dos peixes. Para além disso, verificou--se que a sua presença no plasma seminal é específica de cada espécie e apresenta oscilações dia/noite, tal como sucede na corrente sanguínea. Não obstante, no linguado, a presença de melatonina no plasma seminal demonstrou ter um papel importante no sistema antioxidante deste fluído, independentemente da origem dos reprodutores (selvagens ou F1). O segundo objetivo desta tese consistiu em verificar se as gónadas poderiam ser um local de produção de melatonina extra-pineal. Através de técnicas de PCR quantitativo em tempo real, demonstrou-se que os genes que codificam as enzimas-chave envolvidas na biossíntese da melatonina (tph1a, aanat1a, aanat2, hiomt1) e os seus recetores (mel1 e mel2) se expressam no cérebro, olho e testículo do linguado senegalês, mostrando variações diárias e sazonais, e padrões diferentes de acordo com a origem dos reprodutores. Paralelamente, nos machos F1, as diferenças encontradas nos níveis sazonais de melatonina no sangue e a falta de correlação entre os esteroides sexuais (testosterona e 11-ketotestosterona) no plasma seminal revelaram novas informações sobre a disrupção hormonal do eixo hipotálamo-pituitária-gónada (HPG) nos machos nascidos em cativeiro. Um dos principais objetivos desta tese foi estudar os possíveis efeitos da melatonina endógena e exógena na qualidade do sémen de linguado, de modo a compreender se haveria uma forma não invasiva e sustentável de melhorar a qualidade espermática desta espécie. Assim, desenharam-se dois ensaios de criopreservação distintos, um com dourada e outro com linguado. A criopreservação de sémen é uma técnica muito utilizada em aquacultura e que permite ultrapassar problemas como o da assincronia na obtenção de gametas femininos e masculinos, um problema existente no controle da reprodução do linguado senegalês em cativeiro. Contudo, esta técnica provoca danos celulares que, muitas vezes, comprometem a viabilidade das células após a descongelação. Assim, utilizou-se a melatonina, descrita como um forte agente antioxidante, enquanto suplemento durante a criopreservação de sémen. Com estes ensaios, descobriu-se que a indústria do linguado senegalês poderia beneficiar da recolha de sémen à noite, quando os parâmetros de mobilidade são melhorados pela melatonina produzida naturalmente pelo organismo (endógena). No entanto, a sua suplementação no meio de criopreservação (exógena) não conferiu uma proteção extra aos espermatozoides contra os danos infligidos pelos processos de congelação e descongelação. Contudo, através do recurso à melatonina marcada com fluoresceína e técnicas de microscopia confocal, foi possível observar-se que a melatonina atravessa facilmente a membrana plasmática dos espermatozoides, através de um processo de difusão passiva, espalhando-se pelo núcleo e mitocôndrias. Tal permitiu concluir que o facto de a melatonina não funcionar como um agente antioxidante durante a criopreservação não se devia a falhas técnicas de execução, mas sim a uma eventual inação desta substância provocada pela sua sensibilidade às baixas temperaturas da criopreservação. De forma a explorar o potencial de utilização de outros antioxidantes naturais, nomeadamente antioxidantes provenientes de micro e macroalgas, mas também outras formas de suplementação, desta vez suplementados diretamente na ração dos reprodutores, desenharam-se dois ensaios distintos onde se obtiveram resultados promissores. Em ambos, substituiu-se 6 % da farinha de trigo por 6 % de alga seca aquando da formulação das rações. No primeiro ensaio, com duração de 2 meses, utilizaram-se duas rações experimentais suplementadas com macroalga seca, uma dieta continha Plocamium cartilagineum e a outra Sargassum vulgare. A primeira melhorou a qualidade do sémen, através de uma maior viabilidade e mobilidade dos espermatozoides, enquanto a segunda promoveu o sistema antioxidante das gónadas, com efeitos na capacidade antioxidante do sémen. Num segundo ensaio, formulou-se apenas uma ração com combinação de micro e macroalgas: inclusão de 3 % Phaeodactylum tricornutum e 3 % Gracillaria gracilis, respetivamente. Este ensaio teve a duração de uma época de reprodução, com amostragens quinzenais, de forma a avaliar os efeitos sinérgicos destas algas ao longo do tempo. Porém, a ração combinada não conseguiu diminuir a variabilidade da qualidade do sémen de linguado ao longo da época, mas mostrou-se capaz de diminuir os processos oxidativos e prevenir a fragmentação do DNA em determinados pontos de amostragem. Contudo, os resultados de transcriptómica executados nas gónadas sugerem a existência de um composto não favorável à espermatogénese. Em suma, as diferentes algas, com compostos bioativos distintos, modularam diferentes características dos espermatozoides de acordo com o tipo de algas utilizadas e se utilizadas isoladamente ou combinadas. Numa perspetiva futura, e face aos resultados obtidos nesta tese, a melatonina apresenta aplicabilidade para a indústria quando utilizada de forma natural. No entanto, muito ainda está por descobrir quanto à sua possível aplicação tanto em in vitro como in vivo, nomeadamente se esta hormona poderá ter efeitos na seleção de um parceiro sexual. Tal seria fundamental para a indústria desta espécie, uma vez que os machos F1 de linguado senegalês não apresentam o típico comportamento de corte reprodutiva em cativeiro, o que inviabiliza a reprodução natural desta espécie. Quanto à utilização de dietas suplementadas com algas ricas em antioxidantes, esta tese evidenciou os efeitos benéficos da sua utilização, embora sejam necessários ensaios prolongados e mais investigação sobre o mecanismo de ação dos compostos bioativos das algas para se poder otimizar rações funcionais para a indústria.
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Keywords
Solea senegalensis Antioxidantes Melatonina Qualidade do sémen