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Optimization of Emiliania huxleyi growth for production of n-3 polyunsaturated fatty acids and novel compounds with osteogenic activity
| datacite.subject.fos | Ciências Naturais::Ciências Biológicas | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Varela, J. | |
| dc.contributor.advisor | Barreira, Luísa | |
| dc.contributor.author | Maia, Inês Beatriz Castro | |
| dc.date.accessioned | 2019-09-28T12:07:41Z | |
| dc.date.available | 2019-09-28T12:07:41Z | |
| dc.date.issued | 2019-03-04 | |
| dc.description.abstract | Emiliania huxleyi é uma das mais abundantes espécies de cocolitoforídeos (Haptophyta) e é responsável por vastos blooms em todo o mundo, sendo até visíveis do espaço. A abundância de E. huxleyi nos oceanos sugere fortemente que é uma microalga promissora para a produção industrial de larga escala, com possíveis aplicações biotecnológicas. A sua capacidade de calcificação, devido à produção de placas de calcite, sugere ainda que poderá ser usada para estudos de acidificação dos oceanos, com potencial para mitigação de CO2. E. huxleyi é um organismo unicelular com um reduzido tamanho (4-6 μm) que produz cocólitos em vesículas intracelulares especializadas. Possui também um ciclo de vida haplo-diplonte complexo, com 3 tipos celulares diferentes: células portadoras de cocólitos (células C diploides), células nuas não-móveis (células N) e células móveis portadores de escamas (células S haploides). Os diferentes tipos celulares podem ser induzidos durante o ciclo de vida, levando à diferenciação celular. O ciclo de vida haplo-diplonte tem também um papel muito importante para a sobrevivência da espécie. Esta espécie possui várias caraterísticas com interesse biotecnológico, devido à síntese de ácidos gordos polinsaturados de elevado valor comercial e à produção de pigmentos que poderão servir como substitutos de colorantes artificiais. Além disso, E. huxleyi possui ainda uma caraterística diferente de outras espécies de microalgas mais produzidas industrialmente, que é a produção de cocólitos formados por CaCO3. Estes cocólitos demonstram também grande potencial, com aplicações em nanotecnologia ou ainda como substitutos à calcite industrial. A produção de CaCO3 sugere ainda a presença de compostos com atividade osteogénica. Sete estirpes de E. huxleyi foram adquiridas, procedendo-se ao seu crescimento sob condições controladas. Das sete estirpes, a estirpe RCC1250 foi a selecionada, uma vez que foi a que respondeu melhor às condições de scale-up. Fatores abióticos importantes – meio de cultura, temperatura e intensidade luminosa – foram otimizados para a estirpe E. huxleyi RCC1250 através do uso de fotobiorreatores de escala laboratorial Algem®. Cada ensaio teve a duração de 11 dias, com a monitorização das culturas a cada 2 dias, que incluía: contagens celulares, fluorometria, determinação da concentração de NO3- e observações microscópicas. O desempenho de crescimento foi superior usando Nutribloom® como meio de cultura, quando comparado com o crescimento observado com o meio de cultura K/2, que é considerado o meio de cultura “standard” para esta espécie. A concentração de NO3- também mostrou ser crucial para o crescimento, em que o meio de cultura a uma concentração de NO3- de 0.6 mM demonstrou ser inibitório, numa fase inicial do crescimento. Com este ensaio, ficou definido que o meio de cultura Nutribloom® a uma concentração de 0.3 mM de NO3- seria adicionado no dia 0 e, quando a cultura atingisse uma densidade ótica de 1, esta concentração seria aumentada para 0.6 mM, com adição de meio de cultura a cada 2 dias. A temperatura ótima de crescimento correspondeu a 23 ºC, mas também houve crescimento aos 26 ºC, mostrando um certo nível de adaptação a temperaturas mais altas, o que será vantajoso para uma produção industrial no sul de Portugal. Determinou-se também que 900 μmol fotões/m2/s corresponde à intensidade luminosa ótima em termos de densidade de fluxo de fotões. Foi ainda possível verificar a inibição da fotossíntese em culturas expostas a intensidades luminosas superiores a 1000 μmol fotões/m2/s. As condições “standard” (meio de cultura K/2 a uma concentração de NO3- de 0.3 mM, posteriormente aumentada para 0.6 mM, 17 ºC e 1219 μmol fotões/m2/s) foram também comparadas com as condições otimizadas (meio de cultura Nutribloom® a uma concentração de NO3- de 0.3 mM, posteriormente aumentada para 0.6 mM, 23 ºC e 900 μmol fotões/m2/s), resultando num aumento de crescimento significativo. No final dos ensaios nos fotobiorreatores Algem®, a biomassa foi recolhida por centrifugação e liofilizada para a determinação da composição bioquímica de E. huxleyi. Determinou-se também o conteúdo proteico e de pigmentos, a percentagem de lípidos totais e o perfil de ácidos gordos. A biomassa produzida sob as condições standard continha elevadas quantidades de ácidos gordos saturados e monoinsaturados, nomeadamente os ácidos gordos mirístico, palmítico e oleico. No entanto, a biomassa produzida sob as condições otimizadas continha elevadas quantidades de ácidos gordos polinsaturados (PUFA), nomeadamente os ácidos octadecatetrenóico (OTA) e docosahexenóico (DHA), que são conhecidos pelo seu elevado valor comercial. Aumentaram ainda a produção dos PUFAs anteriores em 4 e 5 vezes, respetivamente. O conteúdo proteico foi também significativamente superior nas culturas expostas às condições otimizadas. Elevadas quantidades de 19’-hexanoilofucoxantina e fucoxantina foram também obtidas sob condições otimizadas, com um aumento de 3 e 2 vezes, respetivamente. O potencial osteogénico de vários extratos de E. huxleyi (etanol, acetato de etilo e água) foi avaliado em larvas de peixe-zebra (Danio rerio) com 3 dias pós-fertilização, expostas por 3 dias a várias concentrações de cada extrato. Os extratos testados não afetaram a área da cabeça das larvas, sendo este o parâmetro usado para a correção da área do opérculo. Análises morfométricas das larvas coloradas com alizarin-red revelaram que o extrato etanólico a 10 μg/mL e 1 μg/mL aumentaram, respetivamente, a área do opérculo em 20 e 11% sobre o controlo (o primeiro tão alto quanto o controlo positivo). A aplicação do extrato de acetato de etilo também levou a um aumento do opérculo em 12% a 100 μg/mL, enquanto o extrato de água não demonstrou nenhum efeito significativo no crescimento do osso. Este ensaio mostrou a presença de compostos pro-osteogénicos, com potencial para desenvolvimento de um novo fármaco. Em conclusão, o presente estudo revelou uma nova perspetiva no impacto dos fatores abióticos no crescimento de E. huxleyi RCC1250. O meio de cultura e a sua concentração de NO3- demonstrou ter um papel fundamental no crescimento desta estirpe, assim como a temperatura e a intensidade luminosa. A otimização destes parâmetros levou também a um aumento significativo na produção de compostos de elevado valor comercial, como PUFAs n-3, fucoxantina e 19’-hexanoilofucoxantina. Deste modo, este trabalho não só permitiu o estabelecimento de um novo protocolo para o melhoramento do crescimento de E. huxleyi, mas também mostrou o seu potencial como uma fonte de compostos de elevado valor comercial e de importantes metabolitos secundários com atividade osteogénica na biomassa produzida. | pt_PT |
| dc.description.abstract | Emiliania huxleyi is one of the most abundant species of coccolithophores (Haptophyta) and is responsible for extensive blooms worldwide. The widespread abundance of E. huxleyi suggests that it may be a promising species for industrial production with high potential for biotechnological applications. Important abiotic factors – culture media, temperature and light intensity – were optimized for E. huxleyi RCC1250 using lab-scale Algem® photobioreactors. Growth performance was higher using Nutribloom® as culture medium as compared to K/2, which is the considered to be the “standard” medium for this species. Optimal temperature and light intensity were, respectively, 23ºC and 900 μmol photons/m2/s in Nutribloom® growth medium. The biomass produced contained high amounts of polyunsaturated fatty acids (PUFA), in particular octadecatetraenoic (OTA) and docosahexaenoic acids (DHA), which are known to have high market value. Optimized conditions increased the production of these PUFAs by 5- and 4-fold, respectively. High amounts of 19’-hexanoyloxyfucoxanthin and fucoxanthin were also achieved under optimized conditions with an increase of 2- and 3-fold. The osteogenic potential of several E. huxleyi extracts (i.e., ethanol, ethyl acetate and water) was assessed in zebrafish (Danio rerio) larvae at 3 days post-fertilization exposed for 3 days to a range of concentrations of each extract. Morphometric analysis of alizarin red-stained larvae revealed that the ethanolic extract at 10 μg/mL and 1 μg/mL increased, respectively, the operculum area by 20 and 11% over the control (the former as high as the positive control). Ethyl acetate extract also induced an operculum increase of 12% at 100 μg/mL, whereas water extract did not show any significant effect on bone growth. In conclusion, this work has not only established a new protocol to improve E. huxleyi growth performance but has shown the presence of high-value compounds and important secondary metabolites with osteogenic activity in the produced biomass. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 202244490 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/12785 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | pt_PT |
| dc.subject | Microalga marinha | pt_PT |
| dc.subject | Emiliania huxleyi | pt_PT |
| dc.subject | Fotobioreatores Algem | pt_PT |
| dc.subject | Atividade osteogénica | pt_PT |
| dc.subject | Danio rerio | pt_PT |
| dc.title | Optimization of Emiliania huxleyi growth for production of n-3 polyunsaturated fatty acids and novel compounds with osteogenic activity | pt_PT |
| dc.type | master thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| rcaap.rights | openAccess | pt_PT |
| rcaap.type | masterThesis | pt_PT |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Ciências e Tecnologia | |
| thesis.degree.level | Mestre | |
| thesis.degree.name | Mestrado em Biologia Molecular e Microbiana | pt_PT |