Nutritional effects of rotifers fed with microalgae blend on the growth and development of zebrafish

Pinheiro, Filipa Maria Ribeiro

http://hdl.handle.net/10400.1/19398

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FilipaPinheiro_MasterThesis-CORRIGIDA2.pdf		1.8 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Pinheiro, Filipa Maria Ribeiro

Advisor(s)

Varela, J.

Gavaia, Paulo

Abstract(s)

O peixe-zebra é o segundo animal modelo mais utilizado na investigação científica, tendo sido usado como modelo para aquacultura em áreas como o desenvolvimento ósseo, oncobiologia e toxicologia. Devido a estes estudos, foi possível, por exemplo, melhorar a utilização da anestesia. O peixe-zebra é um peixe de pequenas dimensões, que apresenta dimorfismo sexual, conseguindo as fêmeas de produzir até 200 ovos. É um peixe robusto e com curto ciclo de vida, com larvas translúcidas. Existe uma grande variedade de linhas mutantes que permite estudos genéticos e de biologia molecular neste organismo modelo. A dieta do peixe zebra no ambiente selvagem baseia-se em zooplâncton, nemátodos e pequenos insetos. Em cativeiro, varia entre comida inerte e alimento vivo, como os rotíferos ou a artémia. Os requisitos nutricionais do peixe zebra ainda não são totalmente conhecidos, mas sabe-se que este organismo modelo necessita aminoácidos essenciais, lípidos, mais propriamente ácidos gordos como os ácidos eicosapentenóico (EPA) e o docosahexenoico (DHA), minerais como o fósforo, o cálcio e o zinco, e vitaminas como as vitaminas A, B e D para que o seu desenvolvimento se faça de uma maneira correta. O desconhecimento e a complexidade das necessidades nutricionais do peixe zebra têm levado à utilização de uma elevada quantidade de protocolos que resultaram numa grande variabilidade biológica entre instituições. Os rotíferos são, assim, ideais para alimentar as larvas durante os seus primeiros dias de vida, devido às suas pequenas dimensões, natação lenta e filtração não seletiva de alimento. No entanto, apresentam um conteúdo nutricional pobre que não vai de encontro às necessidades das larvas de peixe-zebra. As microalgas, por sua vez, são ricas em lípidos, proteínas, minerais, antioxidantes e vitaminas, sendo, deste modo, boas candidatas para o enriquecimento de rotíferos para alimentação de larvas de D. rerio. Os valores nutricionais das microalgas podem ainda ser melhorados através de stress abiótico, como salinidade, alterações no meio nutricional, temperatura ou luminosidade. Assim sendo, o objetivo principal deste trabalho correspondeu à produção de microalgas com perfil bioquímico diferenciado de modo a poder satisfazer as necessidades nutricionais das larvas de peixe zebra. Com esse fim, foram testadas quatro espécies de microalgas (Nannochloropsis oceanica, Tetraselmis verrucosa, Phaeodactylum tricornutum e Nanofrustulum shiloi), utilizando um meio de cultivo comercial Nutribloom Plus (NB+) com duas concentrações de nitratos (2 e 10 mM). As microalgas foram cultivadas à escala laboratorial em fotobiorreatores de 1 L com arejamento e luz constante, durante 9 dias. Ao final de 9 dias, metade das algas foi centrifugada e a outra metade serviu para enriquecer rotíferos, que posteriormente foram também centrifugados e congelados para futuramente serem liofilizados para análise bioquímica. Foram analisados lípidos totais, conteúdo proteico, metilésteres de ácidos gordos (FAME) e, apenas no caso das microalgas, foram também analisados o seu conteúdo mineral e conteúdo inorgânico. A microalga T. verrucosa foi a que apresentou maior crescimento, atingindo 2 g/L de peso seco; já N. oceanica foi a que mostrou maior conteúdo lipídico, sendo P. tricornutum a que apresentou maior conteúdo proteico. Por sua vez, N. shiloi foi a microalga que apresentou maior conteúdo inorgânico. A estirpe selecionada para o passo seguinte foi a T. verrucosa por apresentar uma alta produtividade. Estas microalgas foram cultivadas da mesma maneira ao do teste anterior em que se usou NB+ com 2 (T. verrucosa 2 mM; TF2) ou 10 mM (T. verrucosa 10 mM; TF10) de nitratos, tendo sido usadas para enriquecer rotíferos, para serem posteriormente fornecidos a larvas de peixe-zebra durante 30 dias. Foram ainda testados durante este período rotíferos enriquecidos com Green Formula (GF) e como controlo uma ração comercial (ZF). As larvas foram alimentadas duas vezes por dia, sendo os tanques também limpos por sinfonação duas vezes por dia. Ao final dos 30 dias, as larvas foram eutanasiadas, tendo sido calculada a sobrevivência, medida as suas dimensões (comprimento total) e peso. Foram ainda analisadas as deformações esqueléticas e medidos as vilosidades do intestino médio. Os tratamentos em que foram utilizados rotíferos enriquecidos com microalgas aumentaram significativamente, para cerca de 89%, a sobrevivência das larvas, quando comparadas com a ração comercial com a qual a sobrevivência não foi acima dos 59%. Estes resultados indicam que as larvas apresentam alguma dificuldade na digestão de microdietas nos primeiros dias de vida. As larvas alimentadas com GF foram as que apresentaram maior crescimento. Larvas alimentadas com rotíferos enriquecidos com microalgas apresentaram menor incidência de deformações quando comparadas com o controlo, a ração comercial ZF. Tal resultado pode ser justificado pela biodisponibilidade nutricional, comparando rotíferos e ração. É ainda de realçar que a localização do maior número de deformações das larvas alimentadas com rotíferos foram nas vértebras da barbatana caudal. Larvas alimentadas com TF10 apresentaram vilosidades intestinais maiores. Acredita-se que haja uma relação entre sobrevivência, baixas deformações e tamanho das vilosidades com a saúde dos peixes. Por isso, conclui-se que para os primeiros dias de vida rotíferos enriquecidos com microalgas (T. verrucosa) crescidas em meio enriquecido com 10 mM de nitratos serão uma ótima opção caso se queira produzir larvas de peixe zebra saudáveis, já que este último tratamento melhorou a sobrevivência, diminuiu a incidência de deformações e aumentou as vilosidades intestinais.

Zebrafish is the 2nd most used animal model in scientific research. Its nutritional requirements are yet to be fully understood and, as such, there are a variety of feeding protocols that result in biological variability between institutions. Generally, zebrafish feeding is based on commercial feed and/or live feed, as rotifers. Rotifers are small-sized, slow swimming, non-selective filter feeders, being thus ideal as live feed; however, they have poor nutritional content and therefore need to be enriched. Microalgae are good candidates for enriching rotifers because they are rich in proteins, lipids and minerals. The production of these nutrients can be enhanced with the induction of abiotic stress, as the microalgae produce them to protect themselves from detrimental conditions for growth. The objective of this work was to produce microalgae with different biochemical profiles and to evaluate their effect on zebrafish larvae growth, gut development and skeletal quality. Four species of microalgae (Nannochloropsis oceanica, Tetraselmis verrucosa, Phaeodactylum tricornutum, and Nanofrustulum shiloi) were cultivated with Nutribloom® (NB+) with two concentrations of nitrate (2 and 10 mM). T. verrucosa was the species showing the highest growth rates, being selected to enrich rotifers to be tested on larvae as compared to larvae fed with Green Formula and a commercial feed for 30 days. At the end of the trials, larvae were euthanized, and their weight and length measured. The incidence of deformities and body content were analysed, and the midgut villi length measured. The survival rate of larvae fed with rotifers improved up to 89%, while the survival rate of larvae fed with commercial feed was only 59%. Zebrafish larvae fed with rotifers enriched with T. verrucosa cultivated in NB+ with 10 mM nitrates showed the lowest incidence of skeletal deformities (40%), with minimal vertebral abnormalities. The same treatment promoted the development of the midgut villi, with larvae displaying a villi length of 60 μm in contrast to 40 μm of control-fed larvae. In conclusion, NB+ with 10 mM nitrates offers very promising results both in terms of nutrition and larval quality. T. verrucosa grown in this medium showed to be an effective microalga for rotifer enrichment to produce healthy zebrafish larvae.