Integrin alpha5beta1 and resistance to cancer therapies: role of endocytosis in resistance to gefitinib

Silva, Elisabete Cruz da

Publication

Integrin alpha5beta1 and resistance to cancer therapies: role of endocytosis in resistance to gefitinib

2017-05-29Master thesis

datacite.subject.fos	Ciências Médicas::Ciências da Saúde	pt_PT
dc.contributor.advisor	Ferreira, Bibiana
dc.contributor.author	Silva, Elisabete Cruz da
dc.date.accessioned	2017-09-19T09:30:41Z
dc.date.available	2017-09-19T09:30:41Z
dc.date.issued	2017-05-29
dc.date.submitted	2017
dc.description	Dissertação de mestrado, Oncobiologia - Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2017
dc.description.abstract	Glioblastoma is an aggressive, invasive and resistant brain cancer. Despite the promisor role of EGFR, targeted therapies failed without giving insights about predictive factors. EGFR endocytosis and trafficking have been reported to influenciate therapy resistance. Integrin is known as a regulator of EGFR oncogenic activity during tumor progression by affecting its trafficking. Previous results from the team in cell evasion showed that α5 integrin depletion sensitizes cells to gefitinib treatment. For that, my main objective was to determine if the endocytic pathway is involved in the integrin-mediated resistance to gefitinib. Endocytosis involvement on gefitinib treatment was evaluated by dynamin inhibition. Dynamin is GTPase involved in the fission of endocytic vesicles. There were performed cellular evasion and EGFR internalization assays under gefitinib treatment with or without dynamin chemical inhibitiors (dynasore and dyngo4a). We showed that endocytosis is involved in the gefitinib-mediated inhibition of U87 cell evasion regardless the α5 integrin expression level. Gefitinib induces ligand-bound EGFR internalization, being this impaired with the addiction of dynasore. EGFR and α5β1 integrin distribution were evaluated using immunofluorescence confocal microscopy. Gefitinib was shown to induce internalization of both receptors, being them founded co-localized inside of early endosomal vesicles. Gefitinib induced EGFR internalization occurs in U87 and others glioma cell lines independently of α5 level. We postulate that α5β1 integrin may impact on EGFR trafficking and function during membrane trafficking after endocytosis confering resistance towards gefitinib treatment. There was already described a regulatory role of integrin in EGFR trafficking to promote carcinoma cell invasion, for that this role of integrin should be further evaluated. In conclusion, endocytosis plays a relevant role in gefitinib treatment. EGFR trafficking gains here a strong evidence for its role in therapy resistance. Modulators of this endosomal trafficking, such as α5β1 integrin can predict responsiviness towards EGFR targeted therapies.	pt_PT
dc.description.abstract	Glioblastoma é um dos tumores cerebrais mais agressivos, sendo extremamente invasivo e resistente à terapia. Na sua progressão ocorrem diversas alterações génicas, sendo uma delas a amplificação e/ou mutação do gene erbB 1. O gene erbB 1 codifica o receptor tirosina cinase EGFR, um receptor de sinalização que está envolvido em muitos processos celulares Incluindo a migração, constituindo um importante alvo terapêutico no tratamento do glioblastoma. No entanto, as terapias dirigidas não têm sido bem sucedidas em ensaios clínicos. De momento, não existem quaisquer marcadores predictivos que determinem o carácter responsivo de um paciente a este tipo de terapia. Em outros tipos de cancro, já se encontram descritos diversos mecanismos de resistência, sendo um deles a cooperação entre EGFR e outros receptores, como por exemplo com as integrinas. As integrinas são receptores de adesão celular. Em particular, a integrina α5β1 desempenha um papel importante na progressão do glioma, sendo um descrito alvo terapêutico. Esta integrina encontra-se sobreexpressa em estadios mais avançados da progressão do glioma, estando associada a um pior prognóstico e a um carácter mais invasivo e resistente do tumor. As integrinas e receptores de factores de crescimento como o EGFR cooperam em diversos níveis. A regulação do trafego intracelular já se encontra descrita como um mecanismo de resistência a terapias. Devido ao interesse do grupo no papel da integrina α5β1 na progressão tumoral do glioblastoma, foi previamente geneticamente manipulada uma das mais comuns linhas celulares de glioblastoma (U87). Esta manipulação teve como objectivo a sobre-expressão e a sub-expressão da integrina α5. Estas linhas celulares foram tratadas com gefitinib, um inibidor tirosina cinase especifico para o receptor EGFR, e foi avaliada a evasão celular. A evasão celular foi avaliada através da migração de células de um pequeno agregado celular (esferoide). As células com níveis acrescidos de integrina α5 demonstraram um comportamento resistente após o tratamento com gefitinib. Foi também verificada uma internalização do receptor EGFR após tratamento através da técnica de imunofluorescência. Perante estes resultados os objectivos do meu trabalho foram a verificação do papel da endocitose no tratamento com gefitinib e a importância da integrina α5β1 neste fenótipo. A endocitose foi perturbada pela inibição da dinamina. A dinamina é uma GTPase envolvida na remodelação da membrana celular. Em mamiferos, a família das dinaminas é composta por três isoformas homólogas mas com diferentes padrões de expressão. A dinamina 1 encontra-se apenas expressa em neurónios, a dinamina 2 tem uma expressão ubíqua e a dinamina 3 encontra-se expressa no cérebro e nos testículos. A dinamina está envolvida na fissão de vesículas endociticas, sendo esta função dependente da sua actividade como GTPase. Após a ligação de GTP, a dinamina polimeraliza em torno do pescoço da vesícula. A hidrólise do GTP altera a conformação da dinamina, levando a fissão da vesícula pela geração de forças. A inibição da dinamina foi provocada por dois inibidores químicos diferentes. Dynasore é um inibidor não competitivo da actividade GTPase de ambas dinamina 1 e 2. Dynasore interfere com a actividade catalítica da proteína. Dyngo-4a é um inibidor mais potente, embora seja mais selectivo para dinamina 1 do que para dinamina 2. Dyngo-4a inibe a atividade GTPase ao ligar-se ao domínio G responsável pela ligação e hidrólise ao GTP. A evasão celular foi avaliada com o tratamento com gefitinib e com ou sem inibição das dinaminas. Observou-se uma diminuição da evasão celular após tratamento com gefitinib, verificando-se novamente um carácter mais resistente por parte das células que sobre-expressam integrina α5. A inibição da dinamina reverte completamente o efeito negativo do gefitinib em relação à evasão celular, independentemente do nivel da integrina α5. Observou-se ainda um aumento da evasão celular com os inibidores da dinamina mas apenas na presença de gefitinib. O efeito do gefitinib e dos inibidores da dinamina na internalização do ligando EGF foi avaliado recorrendo ao uso de EGF acopolado com fluorforo. Pode verificar-se que o tratamento com gefitinib aumenta a internalização do ligando, sendo este aumento inibido com a inibição da dinamina. Este fenótipo é integrina α5 independente semelhante ao estudo da evasão celular. Para se averiguar a importância da endocitose no tratamento com gefitinib, imunofluorescência foi efetuada com anticorpos anti-EGFR e anti-EEA1. EEA1 é um marcador de endosomo inicial, sendo este a primeira estrutura vesicular após endocitose/internalização. Foi demonstrado que, após tratamento com gefitinib, EGFR é internalizado e encontra-se em proximidade de EEA1. Esta co-localização aumenta com o tempo de incubação com gefitinib e é integrina α5 independente. Isto demonstra a importância da endocitose neste tratamento. Para determinar se as integrinas também são internalizadas após tratamento com gefitinib, foi realizada imunofluorescência usando anticorpos anti-EGFR e anti-integrina α5 ou integrina β1. Foi demonstrado que após tratamento, EGFR é internalizado juntamente com as integrinas. Devido à limitada resolução da microscopia confocal, esta co-localização foi confirmada por microscopia de super resolução, mais propriamente microscopia estocástica de reconstrução optica. Deste modo, confirmou-se a proximidade destas duas proteínas dentro de estruturas endomembranares. Para verificar se este fenómeno de endocitose ocorre transversalmente em diferentes linhas celulares de glioma foi realizada imunofluorescência usando anticorpos anti-EGFR e anti-integrina β1. Verificou-se que o EGFR foi internalizado em todas as linhas celulares, e que este fenótipo é independente do nível de expressão de integrina α5, visto que as linhas celulares que apresentam um fenótipo mais marcante são as que quase não expressam esta proteína. É de reforçar que nestas linhas celulares apenas foi averiguado a occorrência da internalização de EGFR e integrina β1. Para averiguar o carácter resistente ou sensitivo destas células ao tratamento com gefitinib é necessário futuramente realizar estudos de evasão celular. Além do mais, foram utilizadas as condições de tratamento de gefitinib usadas na linha celular U87. Não foram efetuados nenhuns estudos de toxicidade ou efetividades do gefitinib, de modo a determinar as condições ótimas de concentração e duração de tratamento. Os resultados obtidos sugerem que a migração é independente da endocitose do receptor EGFR, visto que quando a endocitose do receptor é impedida a migração celular é aumentada. A internalização do receptor EGFR após tratamento com gefitinib aparenta ser uma forma de diminuir a sinalização do receptor. A influência da integrina α5 na resistência ao tratamento com gefitinib deverá ser independente da endocitose, provavelmente tendo um papel após a internalização do receptor Alguns estudos mostraram que as alterações no tráfego dos receptores bem como a promoção da sua reciclagem por parte das integrinas funcionam como promotores de tumorigénese e potenciam a progressão tumoral. No caso do glioblastoma ainda não se encontram descritas alterações no tráfego de receptores como promotores de progressão tumoral. Deste modo, este trabalho é um inovador ao demonstrar a importância da endocitose e do trafégo intracelular na resistência à terapia em glioblastoma.	pt_PT
dc.identifier.tid	201709686	pt_PT
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.1/9975
dc.language.iso	eng	pt_PT
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/	pt_PT
dc.subject	Glioblastoma	pt_PT
dc.subject	EGFR	pt_PT
dc.subject	Gefitinib	pt_PT
dc.subject	Integrina α	pt_PT
dc.subject	5β	pt_PT
dc.subject	1	pt_PT
dc.subject	Endocitose	pt_PT
dc.title	Integrin alpha5beta1 and resistance to cancer therapies: role of endocytosis in resistance to gefitinib	pt_PT
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
rcaap.rights	openAccess	pt_PT
rcaap.type	masterThesis	pt_PT
thesis.degree.grantor	Universidade do Algarve, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina
thesis.degree.level	Mestre
thesis.degree.name	Oncobiologia - Mecanismos Moleculares do Cancro	pt_PT