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Dry powders: developing tools to study the impact of inhalation over respiratory epithelium
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Authors
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Abstract(s)
The lung is responsible for the gaseous exchange of carbon dioxide (CO2) with oxygen (O2). Furthermore, within the lung there is an equilibrium that is maintained by a great number of mechanisms that filter the air, making it free of materials that can induce damage. The knowledge of the different lung physiological processes helps understand diseases and promote adequate and efficacious therapies. Additionally, the study of the physics and mechanics of the lungs can work favourably when lung is used as a route of administration for drugs. Nowadays, there is a myriad of marketed inhalers that are mainly used in the therapy of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. These essentially include metered dose inhalers and dry powder inhalers, the latter currently observing increased popularity. Research on the topic of inhalable dry powders is intense, with many formulations being proposed in the literature. After the intrinsic characterisation of formulations, their study continues focusing on behaviour aspects, particularly addressing the interactions with biological structures, such as cells, tissues or animals. These studies require the existence of methodologies and tests that generate reproducible data for a potential approval by the competent authorities. These methodologies can be divided in three categories: in vivo, ex vivo and in vitro tests. When the study of dry powders is focused, it is easier to replicate data in in vivo platforms, not only because animals are used after a careful selection of the best model and subsequent documentation for validation of an experimental setting, but also because dry powders are used and delivered as such. However, in in vitro assays, it is not easy to mimic the lung environment and inhalation itself, as the delivery of powders over cells cultured on an air-liquid interface is required for the drawing of robust conclusions. Often, cell-based in vitro assays entail testing of dry powders in suspension, meaning that the powder is added to the liquid media where cells grow, and the exposure is provided with the mediation of the media. Regrettably, this does not mimic the occurrences in the lung, as the organ is devoid of abundant liquid. In vitro platforms allowing to comply with realistic conditions are relatively scarce and those existing are expensive and technically complex, which is not feasible in early stages of research. The design and development of an affordable and simple in vitro platform capable of testing dry powders, ensuring reproducible experimentation and data, would be highly helpful. This PhD project proposed the development of tools to improve lung delivery research using dry powders. The development of a device that allows the delivery of dry powders onto cell surfaces, thus simulating more appropriately the lung environment, was envisaged. Moreover, a quartz crystal microbalance was used to establish a technique enabling the determination of dry powder deposition profiles. In parallel, the determination of the viability of respiratory cells after the insufflation of a dry powder using the developed device was performed.
Locust bean gum (LBG) is a polysaccharide that has been proposed as excipient in several drug formulation strategies. It has been included in drug delivery systems such as microparticles and nanocarriers, but regrettably LBG does not have the best features for this end, with a low solubility in cold water, the high viscosity of solutions at concentrations above 1% (w/v), and the neutral character, hinder its use. Chemically modified LBG could be a strategy to overcome these limitations. A sulphated derivative of LBG was thus prepared and used in the production of lipid nanocapsules (LNC) by a technique of solvent displacement. Despite adequate properties of the carriers (size around 200 nm, PdI < 0.2, highly negative ζ-potential), encapsulation of the model drug rifabutin failed to achieve satisfactory loadings (< 2%). Moreover, the conversion of LNC into inhalable microparticles by spray-drying using mannitol as carrier matrix, was also not successful, resulting in a negligible amount of powder being recovered. The focus on the formulation used in this PhD project shifted, and the establishment of a spray-drying protocol permitting the production of LBG-based microparticles suitable for lung delivery purposes was investigated. In parallel, an exhaustive study of LBG characteristics, relevant for its role as matrix material, was performed. LBG from three different suppliers was tested, along with a range of spray-drying inlet temperatures, varying between 103 ºC and 160 ºC. The various dry powders were prepared and observed to have similar aspect from a macroscopical visualization. Considering the yields obtained for different temperatures, the chosen formulation was that prepared with an inlet temperature of 130 ± 1 ºC. This temperature ensured a compromise with an inlet temperature that is intermediate and an acceptable production yield around 55-60%. The geometric diameters of the microparticles were determined to vary within 3.8 and 4.5 μm. Further chemical characterisation of LBG was performed (Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR), molecular weight distribution by High Performance Size Exclusion Chromatography (HPSEC), thermogravimetric analysis (TGA) and differential scanning calorimetry (DSC)), evidencing that the heating cycles (for solubilisation and processing in the spray-dryer) might induce LBG depolymerization to a certain extent. However, additional tests are required to confirm these observations, and aerodynamic characterisation of the different LBG-based microparticles is also considered necessary. Notwithstanding, an LBG-based microparticle formulation was chosen to advance to cell-based and in vivo assays. The former relied on cell viability determination, where a concentration-dependent effect was observed. In fact, as concentrations increment, so does the viscosity of LBG, impacting negatively on cell viability. However, testing of LBG did not induce the disruption of the cell membrane and, thus, the release of the cytoplasmatic enzyme lactate dehydrogenase (LDH). As for the in vivo assays, no allergic reaction was initiated in the sequence of the inhalation of LBG microparticles, thus constituting a strong indication of LBG safety for lung drug delivery applications, although more studies, addressing different indicators, are needed. This work demonstrated that a thorough characterisation of polymers works favourably in the process of preparing dry powders, its optimisation and subsequent biological risk assessment.
The design and development of a device enabling the insufflation of dry powders onto cell supports followed the successful preparation of LBG-based microparticles. After several optimisations concerning the model, the method by which the dry powder is weighed and loaded into the device and the air insufflation mechanism, a final model comprised of a funnel and a weighing accessory was conceived. Different 3D printing techniques were also tested to obtain the device (fused deposition modelling and stereolithography), as well as several air pumps. An air compressor was selected as air pump, being tested at different outlet air pressures and using several polysaccharide-based dry powders, but the insufflation yields generally did not go beyond 20-30%, signalling this as a feature requiring future optimisation.
Alveolar epithelial cells were cultured on a petri dish and exposed for 24 h to LBG microparticles, insufflated with the developed device. No significant effect was found on cell viability (always > 70%) and the same was observed after pumping air, indicating potential safety of LBG microparticles and of the proper insufflation method. Future assays assessing other parameters are anyway required to further support these findings.
An application of the device was further explored by means of inclusion of a Quartz Crystal Microbalance (QCM) into the experimental setting, which permitted evaluating the deposition profile of different dry powders in real time, allowing for a more thorough analysis of the device performance. The use of the QCM in cell-based tests, where cells are cultured over the crystal, using the developed device can provide more insight into the real interaction between cells and dry powders. Overall, the inclusion of this technology in experimentation, especially concerning the in vitro analysis of dry powders, can provide more precise data when compared with conventional techniques. In dry powder formulation development, it is advantageous for choosing the most adequate excipients that translates into the best deposition profile. At more advanced stages, the quantification of interactions between cells and particles will be certainly crucial, as the determination of the best excipients for formulations will help on the improvement of the therapeutic approaches. Further developments concerning this PhD project are envisaged, but all that was achieved and the discussion that followed, will certainly guide future endeavours in aerosol research.
O pulmão é um dos órgãos essenciais à vida, sendo responsável pelas trocas gasosas de dióxido de carbono por oxigénio. Para que este processo decorra, existe um equilíbrio que é mantido por diversos tipos de células e diferentes mecanismos, que filtram o ar atmosférico de substâncias que podem danificar o pulmão. O conhecimento dos diferentes processos fisiológicos deste órgão permite compreender as doenças a ele associadas. Além disso, o estudo da física e dos processos mecânicos que ocorrem no pulmão ajudam ao desenvolvimento de terapêuticas mais adequadas e eficazes quando este órgão é usado como via de administração. Atualmente, encontram-se disponíveis no mercado um conjunto de dispositivos, usados na terapêutica da asma e da doença pulmonar obstrutiva crónica, como por exemplo, os inaladores pressurizados com válvula doseadora e os inaladores de pó seco. Estes últimos têm visto, nos últimos anos, um incremento da sua popularidade. Além disso, e em paralelo, a investigação científica no que aos pós secos para inalação diz respeito é profícua e intensa, com diversas formulações a serem propostas na literatura. Após a caracterização intrínseca destas estratégias terapêuticas, o seu estudo prossegue, concentrando-se nas interações com estruturas biológicas como sejam células, tecidos ou animais. Os estudos de desenvolvimento de formulação requerem diversos métodos experimentais e testes, que geram dados reprodutíveis, que serão utilizados pelas autoridades competentes no processo de aprovação de novas terapêuticas. Os métodos experimentais podem ser divididos em três categorias distintas: in vivo, ex vivo e in vitro. Num contexto in vivo, quando se procura caracterizar uma formulação para ser administrada através do pulmão, gerar e replicar dados é uma tarefa relativamente simples, já que se utilizam modelos animais, que foram rigorosamente escolhidos, assim como o método experimental, previamente estudado e validado, usando-se o pó seco como tal. Contudo, nos ensaios in vitro, a mimetização do ambiente pulmonar e do processo de inalação é difícil, já que é necessária a insuflação de pós secos sobre células, que se encontram em cultura numa interface ar-líquido, para que se obtenham conclusões robustas. Atualmente, ensaios de células in vitro requerem experimentação com os pós secos em suspensão, isto é, estes são adicionados ao meio líquido onde as células estão a crescer, e a exposição é mediada por este meio líquido. Contudo, apesar de serem ensaios com peso económico baixo, esses ensaios, tal como estão desenhados atualmente, não mimetizam as condições do pulmão, porque este não tem líquido abundante associado à sua fisiologia. As plataformas in vitro que permitam mimetizar de forma mais realista o ambiente pulmonar são escassas, sendo esta uma necessidade urgente e que precisa de ser suplantada. De facto, esta falta fomenta o uso de alternativas mais caras e complexas, que são inadequadas em estadios mais preliminares de investigação e desenvolvimento. Assim, uma possível solução é o desenho e o desenvolvimento de uma plataforma capaz de ser usada em testes in vitro de pós secos para administração pulmonar, assegurando experimentação reprodutível e, para esse efeito, dados robustos. O trabalho desenvolvido durante o projeto de doutoramento discutido neste documento propôs o desenvolvimento de ferramentas que melhorem a investigação e o desenvolvimento na área pulmonar, utilizando pós secos. Neste caso particular, foi previsto o design e o desenvolvimento de um dispositivo que permite a aerossolização de pós secos sobre um suporte celular, com o intuito de mimetizar o ambiente pulmonar. Além disso, uma microbalança de cristal de quartzo foi utilizada para desenvolver e estabelecer um método experimental para a determinação dos perfis de deposição dos pós secos testados. Paralelamente, a viabilidade celular após insuflação de ar com e sem pós secos com a ajuda do dispositivo foi determinada. A goma de alfarroba é um polissacárido que tem vindo a ser proposto como excipiente em diversas formulações para veiculação de fármacos, tendo sido incluída em trabalhos em que micro- e nanopartículas foram estudadas. Porém, a goma de alfarroba não possui as características químicas mais adequadas para a sua fácil manipulação: baixa solubilidade em água fria, requerendo sempre temperaturas altas para a sua dispersão, a elevada viscosidade quando a concentração da goma é maior do que 1% (m/v) e a ausência de carga. Uma das possíveis soluções para ultrapassar estas limitações é a utilização de uma goma de alfarroba quimicamente modificada. Neste sentido, após a sua purificação e posterior sulfatação, o derivado foi usado na produção de nanocápsulas lipídicas por um processo de deslocamento de solvente. Apesar das características físico-químicas adequadas (tamanhos de cerca de 200 nm, índice de polidispersão < 0.2 e um potencial zeta fortemente negativo), a encapsulação de um fármaco de interesse, a rifabutina, foi inefetiva, não tendo sido atingidos valores de drug loading satisfatórios (< 2%). Além disso, a conversão das nanocápsulas lipídicas em micropartículas inaláveis por um processo de atomização, usando o manitol como matriz, não teve o êxito esperado. A massa de pó seco obtido para esta formulação foi baixa e, por essa razão, a estratégia de formulação de pós secos pensada para o projeto de doutoramento teve de ser ajustada. Assim, procedeu-se à otimização de um protocolo de atomização, que permitisse a produção de micropartículas à base de goma de alfarroba, com características adequadas à sua inalação. Além disso, e em paralelo foi realizado um estudo mais profundo sobre as características físico-químicas da goma de alfarroba. Assim, este polissacárido obtido de três fornecedores diferentes foi usado para este efeito, tendo sido feito um varrimento de temperaturas inlet, entre 103 ºC e 160 ºC. Após a preparação dos respetivos pós secos, uma análise macroscópica preliminar evidenciou características semelhantes entre todos os pós. Assim, considerando os rendimentos de atomização para as diferentes temperaturas inlet testadas, a formulação escolhida foi aquela que foi produzida a 130 ± 1 ºC. Esta temperatura assegura um compromisso entre uma temperatura inlet intermédia e um rendimento de atomização aceitável, entre os 55-60%. Os diâmetros geométricos para as micropartículas produzidas a 130 ºC, com goma de alfarroba de três fornecedores distintos, foram determinados, variando entre 3.8 e 4.5 μm. Uma caracterização química adicional foi realizada (espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), distribuição de pesos moleculares por cromatografia de exclusão por tamanho de alta performance (HPSEC), análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria de varrimento diferencial (DSC)), em que se detetou que sucessivos ciclos de aquecimento (para a solubilização da goma e as altas temperaturas decorrentes do processo de atomização) podem induzir algum grau de despolimerização. Contudo, são necessários mais testes para confirmar esta hipótese, assim como a caracterização aerodinâmica das micropartículas à base de goma de alfarroba. Não obstante, a formulação que havia sido escolhida anteriormente foi utilizada em ensaios com células (in vitro) e animais (in vivo). Os ensaios in vitro evidenciaram um efeito dependente da concentração, ou seja, à medida que a concentração de goma de alfarroba testada aumenta, a sua viscosidade também incrementa, o que impacta negativamente a viabilidade celular. Adicionalmente, experiências com a goma de alfarroba não induziram a disrupção da membrana celular e como tal, a libertação da enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH). Com respeito aos ensaios in vivo, nenhuma reação alérgica foi iniciada na sequência da inalação de micropartículas à base de goma de alfarroba, sendo esta uma forte indicação de que a goma de alfarroba é segura para administração pulmonar. Este trabalho demonstrou que uma caracterização minuciosa e rigorosa de polímeros facilita a preparação de pós secos, a sua otimização e subsequentes testes de determinação de risco biológico. O design e o desenvolvimento de um dispositivo que permita a insuflação de pós secos sobre suportes celulares foi o passo seguinte, após a preparação de micropartículas à base de goma de alfarroba. Após diversas otimizações relativas ao modelo, ao método através do qual o pó seco seria pesado e colocado dentro do dispositivo e ao mecanismo de insuflação que seria aplicado, um modelo final foi produzido, sendo este composto por um funil e por um acessório de pesagem. Diferentes técnicas de impressão 3D foram testadas para a obtenção do dispositivo (modelação por deposição fundida e estereolitografia), assim como diversas estruturas de injeção de ar, das quais se elegeu o compressor de ar. Este último foi posteriormente testado com diferentes pressões de saída de ar e diversos pós secos à base de polissacáridos previamente preparados, mas os rendimentos de insuflação não foram além dos 20-30%, um parâmetro que foi assinalado como sendo necessário otimizar no futuro. Células epiteliais alveolares foram colocadas em cultura numa caixa de petri e expostas, por um período de 24 h, a micropartículas de goma de alfarroba, que foram insufladas com o dispositivo desenvolvido. Os ensaios, de maneira geral, evidenciaram que a insuflação de ar e de pós secos sob uma interface ar-líquido não impactaram negativamente a viabilidade celular, que se manteve em todos os ensaios acima dos 70%, tendo-se obtido resultados semelhantes quando unicamente ar foi insuflado. Estes resultados indicam um perfil de segurança tanto para as micropartículas à base de goma de alfarroba como para o método de insuflação utilizado. Apesar destes resultados, ensaios futuros necessitarão da determinação de outros parâmetros além da viabilidade celular para dar suporte aos resultados obtidos. Uma possível aplicação do dispositivo na análise de pós secos in vitro foi estudada, quando a microbalança de cristal de quartzo foi integrada nas experiências, o que permitiu a avaliação do perfil de deposição de diferentes pós secos em tempo real, permitindo uma análise mais rigorosa do desempenho do dispositivo. Neste sentido, o uso da microbalança de cristal de quartzo em testes celulares futuros poderá providenciar dados importantes a respeito da interação real entre células e pós secos. De uma maneira geral, a inclusão desta tecnologia em experiências, mais concretamente, na análise in vitro de pós secos, mostrar-se-á útil na obtenção de dados mais precisos quando comparados com aqueles gerados por equipamentos mais convencionais. O desenho de formulações de pós secos poderá ver vantagens nesta tecnologia, já que o QCM permitirá a escolha de um polímero que resulte numa formulação com um perfil de deposição muito bom. Além disso, em estadios mais avançados de investigação, a quantificação das interações entre células e partículas será crucial, já que esta determinação permitirá escolher os excipientes mais adequados para serem usados em formulações, com vista ao melhoramento das estratégias terapêuticas atuais. Tal como estas experiências futuras, outros desenvolvimentos focados na melhoria do dispositivo estão previstos, indo além do que foi inicialmente proposto para este projeto de doutoramento. De qualquer maneira, tudo o que foi aqui concretizado e discutido permitirá futuros avanços importantes na investigação e desenvolvimento de aerossóis.
O pulmão é um dos órgãos essenciais à vida, sendo responsável pelas trocas gasosas de dióxido de carbono por oxigénio. Para que este processo decorra, existe um equilíbrio que é mantido por diversos tipos de células e diferentes mecanismos, que filtram o ar atmosférico de substâncias que podem danificar o pulmão. O conhecimento dos diferentes processos fisiológicos deste órgão permite compreender as doenças a ele associadas. Além disso, o estudo da física e dos processos mecânicos que ocorrem no pulmão ajudam ao desenvolvimento de terapêuticas mais adequadas e eficazes quando este órgão é usado como via de administração. Atualmente, encontram-se disponíveis no mercado um conjunto de dispositivos, usados na terapêutica da asma e da doença pulmonar obstrutiva crónica, como por exemplo, os inaladores pressurizados com válvula doseadora e os inaladores de pó seco. Estes últimos têm visto, nos últimos anos, um incremento da sua popularidade. Além disso, e em paralelo, a investigação científica no que aos pós secos para inalação diz respeito é profícua e intensa, com diversas formulações a serem propostas na literatura. Após a caracterização intrínseca destas estratégias terapêuticas, o seu estudo prossegue, concentrando-se nas interações com estruturas biológicas como sejam células, tecidos ou animais. Os estudos de desenvolvimento de formulação requerem diversos métodos experimentais e testes, que geram dados reprodutíveis, que serão utilizados pelas autoridades competentes no processo de aprovação de novas terapêuticas. Os métodos experimentais podem ser divididos em três categorias distintas: in vivo, ex vivo e in vitro. Num contexto in vivo, quando se procura caracterizar uma formulação para ser administrada através do pulmão, gerar e replicar dados é uma tarefa relativamente simples, já que se utilizam modelos animais, que foram rigorosamente escolhidos, assim como o método experimental, previamente estudado e validado, usando-se o pó seco como tal. Contudo, nos ensaios in vitro, a mimetização do ambiente pulmonar e do processo de inalação é difícil, já que é necessária a insuflação de pós secos sobre células, que se encontram em cultura numa interface ar-líquido, para que se obtenham conclusões robustas. Atualmente, ensaios de células in vitro requerem experimentação com os pós secos em suspensão, isto é, estes são adicionados ao meio líquido onde as células estão a crescer, e a exposição é mediada por este meio líquido. Contudo, apesar de serem ensaios com peso económico baixo, esses ensaios, tal como estão desenhados atualmente, não mimetizam as condições do pulmão, porque este não tem líquido abundante associado à sua fisiologia. As plataformas in vitro que permitam mimetizar de forma mais realista o ambiente pulmonar são escassas, sendo esta uma necessidade urgente e que precisa de ser suplantada. De facto, esta falta fomenta o uso de alternativas mais caras e complexas, que são inadequadas em estadios mais preliminares de investigação e desenvolvimento. Assim, uma possível solução é o desenho e o desenvolvimento de uma plataforma capaz de ser usada em testes in vitro de pós secos para administração pulmonar, assegurando experimentação reprodutível e, para esse efeito, dados robustos. O trabalho desenvolvido durante o projeto de doutoramento discutido neste documento propôs o desenvolvimento de ferramentas que melhorem a investigação e o desenvolvimento na área pulmonar, utilizando pós secos. Neste caso particular, foi previsto o design e o desenvolvimento de um dispositivo que permite a aerossolização de pós secos sobre um suporte celular, com o intuito de mimetizar o ambiente pulmonar. Além disso, uma microbalança de cristal de quartzo foi utilizada para desenvolver e estabelecer um método experimental para a determinação dos perfis de deposição dos pós secos testados. Paralelamente, a viabilidade celular após insuflação de ar com e sem pós secos com a ajuda do dispositivo foi determinada. A goma de alfarroba é um polissacárido que tem vindo a ser proposto como excipiente em diversas formulações para veiculação de fármacos, tendo sido incluída em trabalhos em que micro- e nanopartículas foram estudadas. Porém, a goma de alfarroba não possui as características químicas mais adequadas para a sua fácil manipulação: baixa solubilidade em água fria, requerendo sempre temperaturas altas para a sua dispersão, a elevada viscosidade quando a concentração da goma é maior do que 1% (m/v) e a ausência de carga. Uma das possíveis soluções para ultrapassar estas limitações é a utilização de uma goma de alfarroba quimicamente modificada. Neste sentido, após a sua purificação e posterior sulfatação, o derivado foi usado na produção de nanocápsulas lipídicas por um processo de deslocamento de solvente. Apesar das características físico-químicas adequadas (tamanhos de cerca de 200 nm, índice de polidispersão < 0.2 e um potencial zeta fortemente negativo), a encapsulação de um fármaco de interesse, a rifabutina, foi inefetiva, não tendo sido atingidos valores de drug loading satisfatórios (< 2%). Além disso, a conversão das nanocápsulas lipídicas em micropartículas inaláveis por um processo de atomização, usando o manitol como matriz, não teve o êxito esperado. A massa de pó seco obtido para esta formulação foi baixa e, por essa razão, a estratégia de formulação de pós secos pensada para o projeto de doutoramento teve de ser ajustada. Assim, procedeu-se à otimização de um protocolo de atomização, que permitisse a produção de micropartículas à base de goma de alfarroba, com características adequadas à sua inalação. Além disso, e em paralelo foi realizado um estudo mais profundo sobre as características físico-químicas da goma de alfarroba. Assim, este polissacárido obtido de três fornecedores diferentes foi usado para este efeito, tendo sido feito um varrimento de temperaturas inlet, entre 103 ºC e 160 ºC. Após a preparação dos respetivos pós secos, uma análise macroscópica preliminar evidenciou características semelhantes entre todos os pós. Assim, considerando os rendimentos de atomização para as diferentes temperaturas inlet testadas, a formulação escolhida foi aquela que foi produzida a 130 ± 1 ºC. Esta temperatura assegura um compromisso entre uma temperatura inlet intermédia e um rendimento de atomização aceitável, entre os 55-60%. Os diâmetros geométricos para as micropartículas produzidas a 130 ºC, com goma de alfarroba de três fornecedores distintos, foram determinados, variando entre 3.8 e 4.5 μm. Uma caracterização química adicional foi realizada (espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), distribuição de pesos moleculares por cromatografia de exclusão por tamanho de alta performance (HPSEC), análise termogravimétrica (TGA) e calorimetria de varrimento diferencial (DSC)), em que se detetou que sucessivos ciclos de aquecimento (para a solubilização da goma e as altas temperaturas decorrentes do processo de atomização) podem induzir algum grau de despolimerização. Contudo, são necessários mais testes para confirmar esta hipótese, assim como a caracterização aerodinâmica das micropartículas à base de goma de alfarroba. Não obstante, a formulação que havia sido escolhida anteriormente foi utilizada em ensaios com células (in vitro) e animais (in vivo). Os ensaios in vitro evidenciaram um efeito dependente da concentração, ou seja, à medida que a concentração de goma de alfarroba testada aumenta, a sua viscosidade também incrementa, o que impacta negativamente a viabilidade celular. Adicionalmente, experiências com a goma de alfarroba não induziram a disrupção da membrana celular e como tal, a libertação da enzima citoplasmática lactato desidrogenase (LDH). Com respeito aos ensaios in vivo, nenhuma reação alérgica foi iniciada na sequência da inalação de micropartículas à base de goma de alfarroba, sendo esta uma forte indicação de que a goma de alfarroba é segura para administração pulmonar. Este trabalho demonstrou que uma caracterização minuciosa e rigorosa de polímeros facilita a preparação de pós secos, a sua otimização e subsequentes testes de determinação de risco biológico. O design e o desenvolvimento de um dispositivo que permita a insuflação de pós secos sobre suportes celulares foi o passo seguinte, após a preparação de micropartículas à base de goma de alfarroba. Após diversas otimizações relativas ao modelo, ao método através do qual o pó seco seria pesado e colocado dentro do dispositivo e ao mecanismo de insuflação que seria aplicado, um modelo final foi produzido, sendo este composto por um funil e por um acessório de pesagem. Diferentes técnicas de impressão 3D foram testadas para a obtenção do dispositivo (modelação por deposição fundida e estereolitografia), assim como diversas estruturas de injeção de ar, das quais se elegeu o compressor de ar. Este último foi posteriormente testado com diferentes pressões de saída de ar e diversos pós secos à base de polissacáridos previamente preparados, mas os rendimentos de insuflação não foram além dos 20-30%, um parâmetro que foi assinalado como sendo necessário otimizar no futuro. Células epiteliais alveolares foram colocadas em cultura numa caixa de petri e expostas, por um período de 24 h, a micropartículas de goma de alfarroba, que foram insufladas com o dispositivo desenvolvido. Os ensaios, de maneira geral, evidenciaram que a insuflação de ar e de pós secos sob uma interface ar-líquido não impactaram negativamente a viabilidade celular, que se manteve em todos os ensaios acima dos 70%, tendo-se obtido resultados semelhantes quando unicamente ar foi insuflado. Estes resultados indicam um perfil de segurança tanto para as micropartículas à base de goma de alfarroba como para o método de insuflação utilizado. Apesar destes resultados, ensaios futuros necessitarão da determinação de outros parâmetros além da viabilidade celular para dar suporte aos resultados obtidos. Uma possível aplicação do dispositivo na análise de pós secos in vitro foi estudada, quando a microbalança de cristal de quartzo foi integrada nas experiências, o que permitiu a avaliação do perfil de deposição de diferentes pós secos em tempo real, permitindo uma análise mais rigorosa do desempenho do dispositivo. Neste sentido, o uso da microbalança de cristal de quartzo em testes celulares futuros poderá providenciar dados importantes a respeito da interação real entre células e pós secos. De uma maneira geral, a inclusão desta tecnologia em experiências, mais concretamente, na análise in vitro de pós secos, mostrar-se-á útil na obtenção de dados mais precisos quando comparados com aqueles gerados por equipamentos mais convencionais. O desenho de formulações de pós secos poderá ver vantagens nesta tecnologia, já que o QCM permitirá a escolha de um polímero que resulte numa formulação com um perfil de deposição muito bom. Além disso, em estadios mais avançados de investigação, a quantificação das interações entre células e partículas será crucial, já que esta determinação permitirá escolher os excipientes mais adequados para serem usados em formulações, com vista ao melhoramento das estratégias terapêuticas atuais. Tal como estas experiências futuras, outros desenvolvimentos focados na melhoria do dispositivo estão previstos, indo além do que foi inicialmente proposto para este projeto de doutoramento. De qualquer maneira, tudo o que foi aqui concretizado e discutido permitirá futuros avanços importantes na investigação e desenvolvimento de aerossóis.
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