Loading...
Publication
Establishment of a genetic resource bank for restocking management in Portuguese oyster (Crassostrea angulata) and striped venus clam (Chamelea gallina)
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.38 MB | Adobe PDF |
Advisor(s)
Abstract(s)
Bivalves are essential for fisheries, aquaculture, and ecosystems, serving as nutrient-rich resources for human consumption. Despite their significance, many bivalve resources, including Crassostrea angulata (Portuguese oyster) and Chamelea gallina (striped venus clam) in Europe, evidence signs of depletion due to environmental change, anthropogenic impact, and overexploitation, requiring rehabilitation measures. One possible strategy involves establishing a genetic resource bank via cryopreservation. However, cryopreservation presents challenges, requiring optimization of freezing and thawing conditions, particularly the cryoprotectant solution, and understanding cryodamage. The present thesis aims to explore and establish conditions to store and preserve the genetic resources of C. angulata and C. gallina populations. Chapter 1 provides contextual background, on the current situation of bivalve production and the importance of these resources, with special attention on the endangered and valuable species for aquaculture/fisheries, C. angulata and C. gallina. The chapter addresses the fundamental principles of cryobiology and current knowledge on bivalve cryopreservation methodologies for sperm and larvae. This chapter discusses the value of cryodamage assessment tools, emphasizing “omics” molecular tools for high-potential analysis. Chapters 2 and 3 aim to optimize and develop new cryopreservation protocols for the target species. Chapter 2 investigates the effect of the cryoprotectant supplementation with sugars (trehalose and sucrose) on the post-thaw sperm quality of C. angulata. Several methodologies not commonly used in bivalve cryopreservation works were employed, including the determination of reactive oxygen species levels, acrosome integrity and the activity of antioxidant enzymes (superoxide dismutase - SOD, glutathione reductase - GR and glutathione peroxidase - GPX). Sugars supplementation, especially trehalose reduced lipid peroxidation and ROS levels having a positive effect in plasma membrane and acrosome integrity. Chapter 3 evaluates the larval quality of C. angulata and C. gallina exposed and cryopreserved with cryoprotectant solutions that differ in the permeant agent (dimethyl sulfoxide - DMSO and ethylene glycol - EG). The work aimed to understand the effects of cryoprotectant exposure and, cryopreservation on malformations, movement, and enzymatic activity compared with non-exposed larvae. The methodologies for cryopreserving D-larvae of both species were established for the first time. Chapter 4 investigates C. angulata D-larvae cryodamage during cryoprotectant exposure and cryopreservation, using RNA sequencing. This molecular approach was essential for providing evidence that the freezing process was the critical step rather exposure. Furthermore, identified 11 genes as relevant biomarkers of freezability for D-larvae quality assessment. This thesis presents strategies for cryopreserving the genetic material of C. angulata and C. gallina and for cryodamage evaluation.
Os bivalves são importantes recursos para os sectores das pescas e da aquacultura, vista à sua relevância na dieta humana devido ao seu valor nutricional em proteínas, vitaminas e ácidos gordos essenciais. Além disso, como organismos filtradores tem um papel preponderante na regulação do ciclo de nutrientes em ecossistemas, removendo partículas orgânicas e inorgânicas suspensas na água. Contudo, mundialmente, a maioria destes recursos apresentam sinais de declínio, devido às alterações climáticas, impactos antropogénicos e sobre-exploração. Esta situação preocupante não afeta apenas os bancos naturais de bivalves, mas também a atividade pesqueira e produção aquícola destes recursos. Na Europa, a Crassostrea angulata (ostra Portuguesa) e Chamelea gallina (pé-de-burrinho), são exemplos de recursos essenciais para os setores da pesca e aquacultura em risco de desaparecer. Surge, assim, a necessidade de implementar medidas que visem mitigar a perda de recursos genéticos e recuperar essas populações. Uma abordagem possível para a recuperação dos bancos naturais e a preservação da diversidade genética destas espécies passa pela implementação de bancos de recursos genéticos usando a tecnologia de criopreservação. A criopreservação é um processo que suspende as atividade celular através de temperaturas negativas (≈ -196°C) e permite a preservação do material biológico por longos períodos. No entanto, para um processo de criopreservação bem-sucedido, é necessário submeter o material biológico a um conjunto de etapas de preparação, para evitar os danos inerentes ao processo de congelação e descongelação. A seleção da solução crioprotetora, é uma das etapas mais importantes para o processo. Além das estratégias para proteger, é imperativo aplicar metodologias de avaliação de danos, visando uma compreensão mais abrangente sobre o que está a acontecer e implementar medidas para reduzir ou evitar os danos. O propósito principal desta tese foi explorar e estabelecer condições para armazenar e preservar os recursos genéticos das populações de C. angulata e C. gallina, para no futuro estabelecer um programa para reconstruir as populações. O Capítulo 1 proporciona um contexto abrangente sobre os conceitos abordados ao longo da tese. Neste segmento é abordado a situação atual da produção de bivalves a nível mundial e em Portugal. Destaca-se a importância destes recursos, com especial atenção a duas espécies de bivalves europeias, C. angulata e C. gallina, abordando as causas de declínio destes recursos. Os princípios fundamentais da criobiologia são apresentados neste capítulo, com foco ao tipo de crioprotetores e estratégias para otimizar as suas propriedades protetoras, condições de congelação, formas de armazenamento e condições de descongelação. Também são apresentados o estado da arte da criopreservação de bivalves para espermatozoides e larvas, além das várias metodologias para avaliar os danos inerentes à criopreservação em ambos os matérias biológicos. Por conseguinte, o valor das “ómicas” como ferramenta para detetar danos moleculares à criopreservação é explorado. Os Capítulos 2 e 3 tiveram como objetivo otimizar e desenvolver protocolos de criopreservação para espermatozoides e larvas-D de C. angulata e C. gallina. No Capítulo 2 foi explorado o efeito de suplementar o crioprotetor permeável com açúcares (trealose e sacarose) na qualidade dos espermatozoides descongelados de C. angulata. Os açúcares são crioprotetores não-permeáveis, que ao serem combinados com crioprotetores permeáveis apresentam-se como uma estratégia bem-sucedida para reduzir os danos inerentes à criopreservação em espermatozoides de diversas espécies, permitindo estabilizar os constituintes da membrana plasmática. Neste estudo, foi pretendido aplicar um conjunto de técnicas para avaliar a qualidade do sémen descongelado, que não são comumente utilizadas em trabalhos de criopreservação de bivalves. As técnicas incluíam a determinação dos níveis de espécies reativas de oxigénio (ROS), a integridade do acrossoma e atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase – SOD; glutationa redutase – GR; glutationa peroxidase – GPX). A incorporação de açúcares na solução crioprotetora, em particular a trealose, melhorou a integridade da membrana plasmática e reduziu os níveis de ROS, acrossomas danificados (apenas trealose) e a degradação de lípidos. Assim, evidenciamos que a suplementação com açúcares parece ter um papel importante na proteção dos espermatozoides de C. angulata em relação ao stress oxidativo, promovendo a qualidade destes após descongelação, sendo esta compreensão dos resultados possível pela exaustiva avaliação de danos. O objetivo do Capítulo 3 foi desenvolver metodologias para a criopreservação de larvas-D de C. angulata e C. gallina, para as quais não existiam protocolos previamente instituídos. Sendo assim, as larvas-D das espécies-alvo, foram expostas e criopreservadas com duas soluções crioprotetoras que diferiam no composto permeável (dimetilsulfóxido – DMSO e etilenoglicol - EG). Os crioprotetores permeáveis são essências para o sucesso da criopreservação, uma vez, que são capazes de passar pela membrana plasmática substituindo a água intracelular e evitando a formação de cristais de gelo, e, consequentemente, a rutura celular após descongelamento. Contudo, este tipo de compostos apresenta um certo nível de toxicidade para a célula, devendo ser adaptado de acordo com o tipo de material genético e a espécie. A avaliação da qualidade das larvas-D antes e depois da exposição às soluções crioprotetoras e após descongelação, foi analisada considerando alterações morfológicas, parâmetros de movimento e atividade das enzimas antioxidantes (SOD, GR e GPX). Os resultados evidenciaram que nos testes de exposição aos crioprotetores, o DMSO promove alterações morfológicas e aumenta a atividade da GPX nas larvas-D de C. angulata em relação às frescas e ao EG. Quanto ao EG, este diminui significativamente a velocidade das larvas-D de ambas as espécies, sugerindo uma resposta de stress durante a exposição aos crioprotetores. Após a criopreservação verificou-se uma redução significativa na morfologia e nos parâmetros de movimento em relação às larvas-D frescas de ambas as espécies, salvo na morfologia da C. gallina. Foi estabelecido pela primeira vez as metodologias de criopreservação para ambas as espécies. No Capítulo 4, foi aplicado o RNA-seq para avaliar os danos moleculares induzidos pela criopreservação nas larvas-D de C. angulata, com foco nos dois passos críticos de exposição às soluções crioprotetoras e após a descongelação. Este trabalho concluío que o passo crítico foi o processo de congelar e descongelar, mostrando alterações moleculares relacionadas à formação da concha e a malformações, permitindo assim validar os resultados do Capítulo 3. Este estudo identificou 11 genes como biomarcadores moleculares para estudos futuros de danos inerentes à criopreservação. Nesta tese, é providenciado um referencial para as metodologias de criopreservação de espermatozoides e larvas-D, visando estabelecer um banco de recursos genéticos de C. angulata e C. gallina para suportar futuros programas de aquacultura e repovoamento.
Os bivalves são importantes recursos para os sectores das pescas e da aquacultura, vista à sua relevância na dieta humana devido ao seu valor nutricional em proteínas, vitaminas e ácidos gordos essenciais. Além disso, como organismos filtradores tem um papel preponderante na regulação do ciclo de nutrientes em ecossistemas, removendo partículas orgânicas e inorgânicas suspensas na água. Contudo, mundialmente, a maioria destes recursos apresentam sinais de declínio, devido às alterações climáticas, impactos antropogénicos e sobre-exploração. Esta situação preocupante não afeta apenas os bancos naturais de bivalves, mas também a atividade pesqueira e produção aquícola destes recursos. Na Europa, a Crassostrea angulata (ostra Portuguesa) e Chamelea gallina (pé-de-burrinho), são exemplos de recursos essenciais para os setores da pesca e aquacultura em risco de desaparecer. Surge, assim, a necessidade de implementar medidas que visem mitigar a perda de recursos genéticos e recuperar essas populações. Uma abordagem possível para a recuperação dos bancos naturais e a preservação da diversidade genética destas espécies passa pela implementação de bancos de recursos genéticos usando a tecnologia de criopreservação. A criopreservação é um processo que suspende as atividade celular através de temperaturas negativas (≈ -196°C) e permite a preservação do material biológico por longos períodos. No entanto, para um processo de criopreservação bem-sucedido, é necessário submeter o material biológico a um conjunto de etapas de preparação, para evitar os danos inerentes ao processo de congelação e descongelação. A seleção da solução crioprotetora, é uma das etapas mais importantes para o processo. Além das estratégias para proteger, é imperativo aplicar metodologias de avaliação de danos, visando uma compreensão mais abrangente sobre o que está a acontecer e implementar medidas para reduzir ou evitar os danos. O propósito principal desta tese foi explorar e estabelecer condições para armazenar e preservar os recursos genéticos das populações de C. angulata e C. gallina, para no futuro estabelecer um programa para reconstruir as populações. O Capítulo 1 proporciona um contexto abrangente sobre os conceitos abordados ao longo da tese. Neste segmento é abordado a situação atual da produção de bivalves a nível mundial e em Portugal. Destaca-se a importância destes recursos, com especial atenção a duas espécies de bivalves europeias, C. angulata e C. gallina, abordando as causas de declínio destes recursos. Os princípios fundamentais da criobiologia são apresentados neste capítulo, com foco ao tipo de crioprotetores e estratégias para otimizar as suas propriedades protetoras, condições de congelação, formas de armazenamento e condições de descongelação. Também são apresentados o estado da arte da criopreservação de bivalves para espermatozoides e larvas, além das várias metodologias para avaliar os danos inerentes à criopreservação em ambos os matérias biológicos. Por conseguinte, o valor das “ómicas” como ferramenta para detetar danos moleculares à criopreservação é explorado. Os Capítulos 2 e 3 tiveram como objetivo otimizar e desenvolver protocolos de criopreservação para espermatozoides e larvas-D de C. angulata e C. gallina. No Capítulo 2 foi explorado o efeito de suplementar o crioprotetor permeável com açúcares (trealose e sacarose) na qualidade dos espermatozoides descongelados de C. angulata. Os açúcares são crioprotetores não-permeáveis, que ao serem combinados com crioprotetores permeáveis apresentam-se como uma estratégia bem-sucedida para reduzir os danos inerentes à criopreservação em espermatozoides de diversas espécies, permitindo estabilizar os constituintes da membrana plasmática. Neste estudo, foi pretendido aplicar um conjunto de técnicas para avaliar a qualidade do sémen descongelado, que não são comumente utilizadas em trabalhos de criopreservação de bivalves. As técnicas incluíam a determinação dos níveis de espécies reativas de oxigénio (ROS), a integridade do acrossoma e atividade das enzimas antioxidantes (superóxido dismutase – SOD; glutationa redutase – GR; glutationa peroxidase – GPX). A incorporação de açúcares na solução crioprotetora, em particular a trealose, melhorou a integridade da membrana plasmática e reduziu os níveis de ROS, acrossomas danificados (apenas trealose) e a degradação de lípidos. Assim, evidenciamos que a suplementação com açúcares parece ter um papel importante na proteção dos espermatozoides de C. angulata em relação ao stress oxidativo, promovendo a qualidade destes após descongelação, sendo esta compreensão dos resultados possível pela exaustiva avaliação de danos. O objetivo do Capítulo 3 foi desenvolver metodologias para a criopreservação de larvas-D de C. angulata e C. gallina, para as quais não existiam protocolos previamente instituídos. Sendo assim, as larvas-D das espécies-alvo, foram expostas e criopreservadas com duas soluções crioprotetoras que diferiam no composto permeável (dimetilsulfóxido – DMSO e etilenoglicol - EG). Os crioprotetores permeáveis são essências para o sucesso da criopreservação, uma vez, que são capazes de passar pela membrana plasmática substituindo a água intracelular e evitando a formação de cristais de gelo, e, consequentemente, a rutura celular após descongelamento. Contudo, este tipo de compostos apresenta um certo nível de toxicidade para a célula, devendo ser adaptado de acordo com o tipo de material genético e a espécie. A avaliação da qualidade das larvas-D antes e depois da exposição às soluções crioprotetoras e após descongelação, foi analisada considerando alterações morfológicas, parâmetros de movimento e atividade das enzimas antioxidantes (SOD, GR e GPX). Os resultados evidenciaram que nos testes de exposição aos crioprotetores, o DMSO promove alterações morfológicas e aumenta a atividade da GPX nas larvas-D de C. angulata em relação às frescas e ao EG. Quanto ao EG, este diminui significativamente a velocidade das larvas-D de ambas as espécies, sugerindo uma resposta de stress durante a exposição aos crioprotetores. Após a criopreservação verificou-se uma redução significativa na morfologia e nos parâmetros de movimento em relação às larvas-D frescas de ambas as espécies, salvo na morfologia da C. gallina. Foi estabelecido pela primeira vez as metodologias de criopreservação para ambas as espécies. No Capítulo 4, foi aplicado o RNA-seq para avaliar os danos moleculares induzidos pela criopreservação nas larvas-D de C. angulata, com foco nos dois passos críticos de exposição às soluções crioprotetoras e após a descongelação. Este trabalho concluío que o passo crítico foi o processo de congelar e descongelar, mostrando alterações moleculares relacionadas à formação da concha e a malformações, permitindo assim validar os resultados do Capítulo 3. Este estudo identificou 11 genes como biomarcadores moleculares para estudos futuros de danos inerentes à criopreservação. Nesta tese, é providenciado um referencial para as metodologias de criopreservação de espermatozoides e larvas-D, visando estabelecer um banco de recursos genéticos de C. angulata e C. gallina para suportar futuros programas de aquacultura e repovoamento.
Description
Keywords
criopreservação ostra portuguesa (crassostrea angulata) pé-de-burrinho (chamelea gallina) Criopreservação Ostra Portuguesa (Crassostrea angulata) Pé-de-burrinho (Chamelea gallina) Espermatozoides Larvas-D e identificação de criodanos