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Publication
Modelling left ventricular noncompaction cardiomyopathy in cardioids
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Congenital heart defects are the most common deficiency in new-borns. Specifically, a failure during myocardial compaction can lead to excessive trabeculation and intertrabecular recesses seen in left ventricular noncompaction (LVNC). Due to heterogeneity found in patients, more in-depth molecular research, with better disease models, is necessary to identify underlying genetic pathways and pathogenesis. Here, a novel self-assembling human cardioid differentiation protocol was used. Initially, three concentrations of a canonical Wnt pathway activator were tested, and addition of ascorbic acid. A higher concentration led to a full loss of organoids, while ascorbic acid slightly increased the number of organoids discarded but increased the number of beating control-derived organoids. Lastly, with hiPSCs established from LVNC patients, and a healthy relative, three initial seeding densities were tested. We experienced a high degree of heterogeneity in size and morphology, vascularisation formation, number of beating and discarded cardioids. We also analysed organoid circularity at two different stages of differentiation, but no conclusions can be made due to result variability and inconsistency between both cell lines, and/in all seeding conditions presenting no clear pattern. We also experienced a lack of fluorescence signal or a low antibody penetrability after immunofluorescence staining, and increased all incubation periods but still experienced a lack of signal for cardiomyocytes. Then, due to organoid size and density, we observed a low reachable sample depth during fluorescence microscopy. An additional step of ScaleA2 optical clearing was tested, which showed that a 10 day incubation period is crucial for imaging quality and reachable depth improvement. In conclusion, this is a promising but very demanding protocol that has to be thoroughly followed, with many influencing factors. More work is still necessary to improve its efficiency for further studies to determine their cardiac development capacity, and if it can be used to model LVNC in the future.
As doenças cardíacas são a principal causa de morte a nível mundial e incluem uma vasta gama de doenças, entre as quais se incluem as doenças congénitas cardíacas. Estas são responsáveis por 30% de todas as mortes fetais e afetam 0,8-1 em cada 100 recém-nascidos, com malformações graves em ~1 em cada 1000 nascimentos. Isto faz das cardiopatias congénitas a deficiência mais comum em recém-nascidos. Especificamente, quando ocorre uma falha ou alteração nos mecanismos moleculares durante a compactação do miocárdio aquando da formação dos ventrículos, pode conduzir a uma trabeculação excessiva e a recessos intertrabeculares profundos. Este é um fenótipo caraterístico da não compactação do ventrículo esquerdo, uma doença genética com uma grande variação na manifestação dos sintomas. No entanto, devido à heterogeneidade encontrada nos doentes a nível genético e fenotípico, são necessários estudos moleculares mais aprofundados, com modelos de doença mais fiáveis, para identificar vias genéticas subjacentes à patogénese, que ainda permanecem desconhecidas. Os estudos atuais têm sido realizados principalmente com recurso a modelos animais, com alguns modelos complementares de células em monocamadas, como cardiomiócitos. No entanto, as diferenças entre os animais e os seres humanos podem influenciar a adaptação dos estudos em seres humanos, enquanto os modelos celulares em monocamada estão ainda muito longe da complexidade estrutural e celular do coração. Os organóides cardíacos têm o potencial de serem esses modelos alternativos, uma vez que são estruturas celulares tridimensionais que mimetizam, até um certo ponto, o desenvolvimento do coração, a composição celular e a arquitetura, e podem ser obtidos utilizando células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) estabelecidas a partir de doentes. Visto que ainda não foram realizados estudos nestes modelos especificamente para a não-compactação do ventrículo esquerdo, o foco principal deste projeto é avaliar se estas estruturas tridimensionais têm potencial para estudos de não compactação do ventrículo esquerdo, no futuro. Neste projeto foi implementado um protocolo recente de diferenciação de organoides cardíacos humanos, por meio de auto-organização. Este protocolo tem como base a modulação da via de sinalização Wnt em três etapas, começando pela sua ativação, por um ativador canónico da via Wnt, seguido pela sua inibição, por um antagonista da Wnt através da inibição de PORCN, e uma última ativação. Inicialmente, foram testadas três concentrações diferentes do ativador da via Wnt, assim como a adição de ácido ascórbico. Observámos que uma concentração mais elevada afeta negativamente o desenvolvimento cardíaco. Por outro lado, embora o ácido ascórbico poderá ter causado a perda de alguns organóides, parece também ter aumentado ligeiramente o número de organóides a bater derivados de uma linha celular controlo de teste, para além de terem sido os únicos onde vascularização foi observada. Depois, com hiPSCs estabelecidas a partir de doentes com não compactação do ventrículo esquerdo, e de um familiar saudável, testamos três densidades celulares iniciais para a formação de corpos embrióides, 8000, 10000 e 12000 células/poço. Os nossos resultados aparentam ter um elevado grau de heterogeneidade a nível de tamanho e morfologia, sendo por vezes variável, ao longo das diferenciações. Isto poderá ser explicado por não ter sido usada a micropipeta multicanal para transferir as células para placas de fundo redondo de aderência ultrabaixa com 96 poços. Observou-se também uma elevada perda de organoides ao longo das diferenciações por se terem desintegrado, onde se observa um claro aumento no número de células visíveis no fundo dos poços. Ainda assim, fomos capazes de observar organóides com contrações robustas e regulares, embora nem todos acabassem por bater. Dos que batiam, também observamos que em alguns casos apenas zonas de projeções celulares, que se desenvolviam na superfície do organóide, se encontravam a bater, ou que nem todos chegavam até ao fim da diferenciação ainda a bater. (...)
As doenças cardíacas são a principal causa de morte a nível mundial e incluem uma vasta gama de doenças, entre as quais se incluem as doenças congénitas cardíacas. Estas são responsáveis por 30% de todas as mortes fetais e afetam 0,8-1 em cada 100 recém-nascidos, com malformações graves em ~1 em cada 1000 nascimentos. Isto faz das cardiopatias congénitas a deficiência mais comum em recém-nascidos. Especificamente, quando ocorre uma falha ou alteração nos mecanismos moleculares durante a compactação do miocárdio aquando da formação dos ventrículos, pode conduzir a uma trabeculação excessiva e a recessos intertrabeculares profundos. Este é um fenótipo caraterístico da não compactação do ventrículo esquerdo, uma doença genética com uma grande variação na manifestação dos sintomas. No entanto, devido à heterogeneidade encontrada nos doentes a nível genético e fenotípico, são necessários estudos moleculares mais aprofundados, com modelos de doença mais fiáveis, para identificar vias genéticas subjacentes à patogénese, que ainda permanecem desconhecidas. Os estudos atuais têm sido realizados principalmente com recurso a modelos animais, com alguns modelos complementares de células em monocamadas, como cardiomiócitos. No entanto, as diferenças entre os animais e os seres humanos podem influenciar a adaptação dos estudos em seres humanos, enquanto os modelos celulares em monocamada estão ainda muito longe da complexidade estrutural e celular do coração. Os organóides cardíacos têm o potencial de serem esses modelos alternativos, uma vez que são estruturas celulares tridimensionais que mimetizam, até um certo ponto, o desenvolvimento do coração, a composição celular e a arquitetura, e podem ser obtidos utilizando células estaminais pluripotentes induzidas humanas (hiPSC) estabelecidas a partir de doentes. Visto que ainda não foram realizados estudos nestes modelos especificamente para a não-compactação do ventrículo esquerdo, o foco principal deste projeto é avaliar se estas estruturas tridimensionais têm potencial para estudos de não compactação do ventrículo esquerdo, no futuro. Neste projeto foi implementado um protocolo recente de diferenciação de organoides cardíacos humanos, por meio de auto-organização. Este protocolo tem como base a modulação da via de sinalização Wnt em três etapas, começando pela sua ativação, por um ativador canónico da via Wnt, seguido pela sua inibição, por um antagonista da Wnt através da inibição de PORCN, e uma última ativação. Inicialmente, foram testadas três concentrações diferentes do ativador da via Wnt, assim como a adição de ácido ascórbico. Observámos que uma concentração mais elevada afeta negativamente o desenvolvimento cardíaco. Por outro lado, embora o ácido ascórbico poderá ter causado a perda de alguns organóides, parece também ter aumentado ligeiramente o número de organóides a bater derivados de uma linha celular controlo de teste, para além de terem sido os únicos onde vascularização foi observada. Depois, com hiPSCs estabelecidas a partir de doentes com não compactação do ventrículo esquerdo, e de um familiar saudável, testamos três densidades celulares iniciais para a formação de corpos embrióides, 8000, 10000 e 12000 células/poço. Os nossos resultados aparentam ter um elevado grau de heterogeneidade a nível de tamanho e morfologia, sendo por vezes variável, ao longo das diferenciações. Isto poderá ser explicado por não ter sido usada a micropipeta multicanal para transferir as células para placas de fundo redondo de aderência ultrabaixa com 96 poços. Observou-se também uma elevada perda de organoides ao longo das diferenciações por se terem desintegrado, onde se observa um claro aumento no número de células visíveis no fundo dos poços. Ainda assim, fomos capazes de observar organóides com contrações robustas e regulares, embora nem todos acabassem por bater. Dos que batiam, também observamos que em alguns casos apenas zonas de projeções celulares, que se desenvolviam na superfície do organóide, se encontravam a bater, ou que nem todos chegavam até ao fim da diferenciação ainda a bater. (...)
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Keywords
Cardiopatia congénita Não-compactação do ventrículo esquerdo Modelos de doença Diferenciação Diferenciação de células estaminais Organóides cardíacos humanos