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Publication
Abundance and distribution of coral fluorescent proteins along an artificial light gradient
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Authors
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Abstract(s)
Corals in nearshore marine environments are exposed to a depth-light gradient imposed by the attenuation of light with depth. To a certain extent, corals are adapted to a broad range of available irradiances by producing changes in their physiology. One solution that coral organisms have, to cope with this different light condition, is through fluorescent proteins (FPs). FPs produced by corals have many roles including photoprotection and thermal stress resilience thus being one of the mechanisms by which corals can adapt to different conditions. In this study, I investigate the existence of inter- and intra-specific variation in tissue location, emission intensity, and spectral curve of FPs. These differences suggest potential differential roles and expression of FPs inside a colony at tissue level, among colonies, light habitats and even amongst different species.
Grande parte das espécies de corais existentes atualmente são zooxanteladas, o que significa que vivem em simbiose com dinoflagelados fotossintéticos comummente designados por Zooxantelas (Filo: Dinoflagellata, Família: Symbiodiniaceae). Estas microalgas endosimbiontes são muito importantes para o coral hospedeiro, na medida em que contribuem com grande parte da matéria orgânica por si produzidas através da utilização da energia do sol. Consequentemente, a luz é um grande fator ambiental que delimita a presença e o crescimento dos recifes de coral. Recifes de coral podem ser encontrados desde águas rasas até grandes profundidades onde a luz é escassa. Ao longo deste gradiente de luz, é possível encontrar corais restritos a condições de maior luminosidade, outros especializados a habitar águas profundas, e ainda espécies generalistas que ocupam habitats distintos. As condições de luminosidade variam muito com a profundidade, em termos de quantidade e qualidade. A intensidade de luz que chega a ecossistemas mesofóticos (30m – 150m) é uma fração mínima (~1%) da luz que atinge a superfície da água. Este valor depende de muitos fatores, como por exemplo a presença de sedimento, partículas e microrganismos em suspensão na coluna de água, ente outros, que contribuem para turbidez, sumarizada pelo coeficiente de atenuação da luz na água. Para além disso, corais encontrados a grandes profundidades, encontram-se expostos a luz restrita a comprimentos de onda tendencialmente menores (violeta-azuis). Face a estas mudanças na quantidade e qualidade da luz, corais em ambientes mesofóticos e corais presentes em águas rasas encontram-se em condições luminosas completamente diferentes. Corais da mesma espécie, existentes nos dois extremos, possuem mecanismos de aclimatização que lhes permitem aproveitar ao máximo a luz e potenciar assim o seu crescimento e reprodução. Sendo um organismo simbiótico, a aclimatização do coral a ambientes de baixa luminosidade pode ser manifestada a nível do simbionte e/ou do animal/hospedeiro. As zooxantelas simbiontes são também organismos dinâmicos capazes de se aclimatizar à mudança de luz. Alguns dos mecanismos de aclimatização a baixas intensidades de luz incluem, regulação da quantidade e proporção de pigmentos fotossintéticos (como por exemplo o incremento da quantidade de clorofila nos cloroplastos), regulação de antioxidantes e aumento do tamanho celular. Para além disso, mecanismos de aclimatização também são manifestados a nível do animal como regulação do número de zooxantelas nos tecidos (de modo a minimizar o auto-sombreamento), mudanças na morfologia da colónia de coral (de modo a maximizar a exposição do tecido à luz e diminuir o auto-sombreamento), características do esqueleto (modificando assim a luz interna) e finalmente, modificação na expressão e localização de proteínas fluorescentes (PFs). Consequentemente, corais em ambientes profundos possuem uma eficiência de utilização da luz mais alta, contudo, é sugerido que estes corais dependem mais da heterotrofia como a sua fonte de energia principal. PFs de corais são grandes determinantes da diversidade de cores encontrada em recifes. Existem três cores básicas de PFs de corais (azul-ciano, verde e vermelho) sendo que existem outros morfotipos. A cor deste pigmento é determinada pela sequência de ADN de um único gene, o que proporciona uma oportunidade para o estudo da evolução da cor dos recifes de coral a nível molecular. A variação na cor entre indivíduos da mesma espécie pode dever-se a diferenças no número de cópias do gene para a PF, devido a polimorfismos no genoma, ou até mesmo devido a uma diferente regulação na expressão de PFs. Os corais podem expressar uma ou múltiplas PFs, o que resulta potencialmente numa alteração da sua cor ao longo do ciclo de vida, devido a fatores ambientais e ao longo de um gradiente de luz (por exemplo com a profundidade), relevante para este estudo. As funções das PFs na ecologia dos corais não são totalmente compreendidas, contudo, a maioria dos autores concordam que as PFs contribuem para um melhoramento de processos fotossintéticos em ambientes de luz escassa. Em águas rasas, onde a excessiva intensidade de luz é prejudicial, desempenham um papel de fotoproteção (ensombreando as zooxantelas e dissipando o excesso de energia, o que preserva os fotossistemas e previne a formação de espécies reativas de oxigénio). Para caracterizar, identificar e estudar a variação de PFs em corais, foi usado um microscópio confocal para a obtenção de imagens de fluorescência, assim como as curvas de emissão de fluorescência de PFs. A microscopia confocal é uma técnica ótica de obtenção de imagens de alta resolução com grande contraste e seleção do ponto de focagem. Como técnicas confocais focam a luz numa zona reduzida, todo o ruido que não esteja no plano focal é eliminado o que permite observar fontes de fluorescência que passam despercebidas em métodos de microscopia convencional. Para quantificar quantidades de clorofila e proteína presentes no coral recorri a métodos de espectrofotometria. Este estudo confirmou a existência de mecanismos de aclimatização em corais presentes no Oceanário Haus des Meeres, Viena e descreve características como localização e curva de emissão de PFs. Estas PFs são vistas por todo o tecido de coral, associadas a diferentes estruturas como a epiderme, tentáculos e tecido muscular. Foi confirmada a existência de múltiplas PFs, muitas vezes colocalizadas apesar de que em microscopia convencional podem ser confundidas como apenas uma cor devido à sua sobreposição. Isto sugere que a cor fluorescente dominante pode ser determinada através de um gradiente de PFs, visível em Echinopora lamellosa. Nesta espécie de coral é visível fluorescência verde em redor do disco oral dos pólipos que dá lugar a fluorescência azul mais perto do coenosarco (tecido inter-pólipo). Neste trabalho também foi possível identificar diferenças inter e intra-especificas de PFs em duas espécies de corais (Echinopora lamellosa e Stylophora pistillata) presentes no oceanário “Haus des Meeres” em Viena. Para além disso, comparando as curvas de emissão entre colónias expostas a diferentes intensidades de luz e entre espécies de coral distintas, foi possível identificar diferenças nomeadamente nas PFs ciano-azul. Foi encontrado em Stylophora pistillata um pico de emissão a 479nm que não foi encontrado em Echinopora lamellosa. O facto de a fluorescência ciano-azul ser dominante em diferentes estruturas nas duas espécies sugere que a maior componente azul em S. pistillata desempenha uma função específica na estrutura à qual se encontra associada. Finalmente, aclimatização de várias colónias de coral foi confirmada também a nível dos simbiontes. Foi observado um menor número de zooxantelas e uma maior concentração de clorofila em colónias que vivem sob baixa luminosidade. Contrariamente ao que era esperado, uma maior intensidade de fluorescência foi obtida em níveis médios de luminosidade e não em altas intensidades de luz. O trabalho científico desenvolvido nesta tese pode e deve ser melhorado em pesquisas futuras principalmente incluindo métodos otimizados de obtenção de curvas de emissão de PFs. Aumentando a diferença de luminosidade entre colónias estudadas também seria relevante para replicar e avaliar condições in situ com maior precisão e entender e estudar diferenças nas PFs de corais. Este estudo contribuiu para o trabalho corrente sobre fluorescência em corais produzindo imagens histológicas de grande qualidade assim como a identificação de variações nas PFs, chave para um melhor conhecimento do impacto de PFs na eco fisiologia de corais.
Grande parte das espécies de corais existentes atualmente são zooxanteladas, o que significa que vivem em simbiose com dinoflagelados fotossintéticos comummente designados por Zooxantelas (Filo: Dinoflagellata, Família: Symbiodiniaceae). Estas microalgas endosimbiontes são muito importantes para o coral hospedeiro, na medida em que contribuem com grande parte da matéria orgânica por si produzidas através da utilização da energia do sol. Consequentemente, a luz é um grande fator ambiental que delimita a presença e o crescimento dos recifes de coral. Recifes de coral podem ser encontrados desde águas rasas até grandes profundidades onde a luz é escassa. Ao longo deste gradiente de luz, é possível encontrar corais restritos a condições de maior luminosidade, outros especializados a habitar águas profundas, e ainda espécies generalistas que ocupam habitats distintos. As condições de luminosidade variam muito com a profundidade, em termos de quantidade e qualidade. A intensidade de luz que chega a ecossistemas mesofóticos (30m – 150m) é uma fração mínima (~1%) da luz que atinge a superfície da água. Este valor depende de muitos fatores, como por exemplo a presença de sedimento, partículas e microrganismos em suspensão na coluna de água, ente outros, que contribuem para turbidez, sumarizada pelo coeficiente de atenuação da luz na água. Para além disso, corais encontrados a grandes profundidades, encontram-se expostos a luz restrita a comprimentos de onda tendencialmente menores (violeta-azuis). Face a estas mudanças na quantidade e qualidade da luz, corais em ambientes mesofóticos e corais presentes em águas rasas encontram-se em condições luminosas completamente diferentes. Corais da mesma espécie, existentes nos dois extremos, possuem mecanismos de aclimatização que lhes permitem aproveitar ao máximo a luz e potenciar assim o seu crescimento e reprodução. Sendo um organismo simbiótico, a aclimatização do coral a ambientes de baixa luminosidade pode ser manifestada a nível do simbionte e/ou do animal/hospedeiro. As zooxantelas simbiontes são também organismos dinâmicos capazes de se aclimatizar à mudança de luz. Alguns dos mecanismos de aclimatização a baixas intensidades de luz incluem, regulação da quantidade e proporção de pigmentos fotossintéticos (como por exemplo o incremento da quantidade de clorofila nos cloroplastos), regulação de antioxidantes e aumento do tamanho celular. Para além disso, mecanismos de aclimatização também são manifestados a nível do animal como regulação do número de zooxantelas nos tecidos (de modo a minimizar o auto-sombreamento), mudanças na morfologia da colónia de coral (de modo a maximizar a exposição do tecido à luz e diminuir o auto-sombreamento), características do esqueleto (modificando assim a luz interna) e finalmente, modificação na expressão e localização de proteínas fluorescentes (PFs). Consequentemente, corais em ambientes profundos possuem uma eficiência de utilização da luz mais alta, contudo, é sugerido que estes corais dependem mais da heterotrofia como a sua fonte de energia principal. PFs de corais são grandes determinantes da diversidade de cores encontrada em recifes. Existem três cores básicas de PFs de corais (azul-ciano, verde e vermelho) sendo que existem outros morfotipos. A cor deste pigmento é determinada pela sequência de ADN de um único gene, o que proporciona uma oportunidade para o estudo da evolução da cor dos recifes de coral a nível molecular. A variação na cor entre indivíduos da mesma espécie pode dever-se a diferenças no número de cópias do gene para a PF, devido a polimorfismos no genoma, ou até mesmo devido a uma diferente regulação na expressão de PFs. Os corais podem expressar uma ou múltiplas PFs, o que resulta potencialmente numa alteração da sua cor ao longo do ciclo de vida, devido a fatores ambientais e ao longo de um gradiente de luz (por exemplo com a profundidade), relevante para este estudo. As funções das PFs na ecologia dos corais não são totalmente compreendidas, contudo, a maioria dos autores concordam que as PFs contribuem para um melhoramento de processos fotossintéticos em ambientes de luz escassa. Em águas rasas, onde a excessiva intensidade de luz é prejudicial, desempenham um papel de fotoproteção (ensombreando as zooxantelas e dissipando o excesso de energia, o que preserva os fotossistemas e previne a formação de espécies reativas de oxigénio). Para caracterizar, identificar e estudar a variação de PFs em corais, foi usado um microscópio confocal para a obtenção de imagens de fluorescência, assim como as curvas de emissão de fluorescência de PFs. A microscopia confocal é uma técnica ótica de obtenção de imagens de alta resolução com grande contraste e seleção do ponto de focagem. Como técnicas confocais focam a luz numa zona reduzida, todo o ruido que não esteja no plano focal é eliminado o que permite observar fontes de fluorescência que passam despercebidas em métodos de microscopia convencional. Para quantificar quantidades de clorofila e proteína presentes no coral recorri a métodos de espectrofotometria. Este estudo confirmou a existência de mecanismos de aclimatização em corais presentes no Oceanário Haus des Meeres, Viena e descreve características como localização e curva de emissão de PFs. Estas PFs são vistas por todo o tecido de coral, associadas a diferentes estruturas como a epiderme, tentáculos e tecido muscular. Foi confirmada a existência de múltiplas PFs, muitas vezes colocalizadas apesar de que em microscopia convencional podem ser confundidas como apenas uma cor devido à sua sobreposição. Isto sugere que a cor fluorescente dominante pode ser determinada através de um gradiente de PFs, visível em Echinopora lamellosa. Nesta espécie de coral é visível fluorescência verde em redor do disco oral dos pólipos que dá lugar a fluorescência azul mais perto do coenosarco (tecido inter-pólipo). Neste trabalho também foi possível identificar diferenças inter e intra-especificas de PFs em duas espécies de corais (Echinopora lamellosa e Stylophora pistillata) presentes no oceanário “Haus des Meeres” em Viena. Para além disso, comparando as curvas de emissão entre colónias expostas a diferentes intensidades de luz e entre espécies de coral distintas, foi possível identificar diferenças nomeadamente nas PFs ciano-azul. Foi encontrado em Stylophora pistillata um pico de emissão a 479nm que não foi encontrado em Echinopora lamellosa. O facto de a fluorescência ciano-azul ser dominante em diferentes estruturas nas duas espécies sugere que a maior componente azul em S. pistillata desempenha uma função específica na estrutura à qual se encontra associada. Finalmente, aclimatização de várias colónias de coral foi confirmada também a nível dos simbiontes. Foi observado um menor número de zooxantelas e uma maior concentração de clorofila em colónias que vivem sob baixa luminosidade. Contrariamente ao que era esperado, uma maior intensidade de fluorescência foi obtida em níveis médios de luminosidade e não em altas intensidades de luz. O trabalho científico desenvolvido nesta tese pode e deve ser melhorado em pesquisas futuras principalmente incluindo métodos otimizados de obtenção de curvas de emissão de PFs. Aumentando a diferença de luminosidade entre colónias estudadas também seria relevante para replicar e avaliar condições in situ com maior precisão e entender e estudar diferenças nas PFs de corais. Este estudo contribuiu para o trabalho corrente sobre fluorescência em corais produzindo imagens histológicas de grande qualidade assim como a identificação de variações nas PFs, chave para um melhor conhecimento do impacto de PFs na eco fisiologia de corais.
Description
Keywords
Light gradient Fluorescent proteins Emission spectra Laser scanning confocal microscopy