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Modulation of a RBP as potential therapeutic strategy for SCA2

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Abstract(s)

Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is one of the nine polyglutamine disease (polyQ), characterized by an abnormally long expansion of the adenine-cytosine-guanine (CAG) trinucleotide within each respective disease-associated gene. PolyQ diseases are dominantly inherited neurodegenerative disorders in which, affected people experience a myriad of highly debilitating motor symptoms. SCA2 arises from a mutation within the coding region of the ATXN2 gene, which is translated into ataxin-2 protein bearing an abnormally long polyQ tract. This mutant protein is prone to aggregate and known to gain toxic function, which is in the basis for disrupting several molecular pathways, which ultimately lead to neuronal death, within specific brain region, including the pons and the cerebellum. Among other, these disrupted pathways might include aberrant RNA metabolism or even loss of cellular proteostasis. Unfortunately, there are no therapeutic options capable of preventing such pathways to became dysregulated, which mean that people affected by SCA2 have no therapies able to cure nor delay the disease progression, ultimately suffering a premature death. To understand whether reestablishing cellular proteostasis could, in fact mitigate SCA2-associated pathology we sought to evaluate the impact of expressing HSPA8, a crucial chaperone involved in the mechanism of proteome homeostasis. In this work we used both in vitro and in vivo approaches to assess whether HSPA8 expression was able prevent SCA2 pathology. We observed that in in vitro models of SCA2 and in an in vivo lentiviral model of this disease, HSPA8 expression was able to both prevent the number of ataxin-2 aggregates and at the same time preserve the neuronal tissue. This work suggests that the expression of HSPA8, a chaperone involved in the mechanism of cellular proteostasis, was able to mitigate SCA2-associated disease hallmarks. Therefore, HPSPA8 could represent a novel therapeutic target for SCA2.
A ataxia espinocerebelosa do tipo 2 (SCA2, do inglĆŖs spinocerebellar ataxia type 2) Ć© uma doenƧa neurodegenerativa, autossĆ³mica dominante, que se encontra inserida num grupo de nove doenƧas conhecidas por doenƧas de poliglutaminas (PolyQ), e que partilham entre si diversos mecanismos patolĆ³gicos. De entre as diversas formas hereditĆ”rias de ataxia, a SCA2 representa a segunda mais prevalente a nĆ­vel mundial. Esta doenƧa caracteriza-se pela progressĆ£o de um conjunto de sintomas debilitantes, sendo a ataxia cerebelosa o sintoma clĆ­nico mais predominante. Adicionalmente, os doentes de SCA2 podem tambĆ©m apresentar outros sintomas resultantes da degeneraĆ§Ć£o cerebelosa como a disartria, rigidez muscular, disfagia, assim como outras manifestaƧƵes nĆ£o cerebelosas, como movimentos sacĆ”dicos oculares lentos, contraƧƵes musculares involuntĆ”rias e mioclonia. Atualmente, os tratamentos disponĆ­veis sĆ£o unicamente sintomĆ”ticos, nĆ£o existindo uma terapia eficaz, capaz de atrasar ou parar a progressĆ£o da doenƧa. A SCA2 surge como consequĆŖncia de uma expansĆ£o anormal do trinucleĆ³tido citosina-adenina-guanina presente na exĆ£o 1, na regiĆ£o codificante do gene ATXN2. A expansĆ£o anormal de CAGs Ć© conhecida por estar na raiz da patologia inerente Ć  SCA2. Esta mutaĆ§Ć£o conduz Ć  sĆ­ntese de uma proteĆ­na ā€“ ataxina-2 ā€“ que contĆ©m uma sequĆŖncia de glutaminas anormalmente expandida, que quando, igual ou superior a 32 glutaminas Ć© responsĆ”vel pela manifestaĆ§Ć£o do fenĆ³tipo de SCA2. A proteĆ­na ataxina-2, em condiƧƵes normais, desempenha funƧƵes biolĆ³gicas essenciais, entre as quais modificaƧƵes pĆ³s-transcricionais, regulaĆ§Ć£o da traduĆ§Ć£o, formaĆ§Ć£o de grĆ¢nulos de stress, homeostase do cĆ”lcio, assim como processos de endocitose e reorganizaĆ§Ć£o do citoesqueleto. No entanto, a forma mutante da ataxina-2 tende a agregar, conduzindo Ć  formaĆ§Ć£o de oligĆ³meros e, eventualmente, Ć  acumulaĆ§Ć£o de agregados proteicos insolĆŗveis capazes de gerar toxicidade neuronal e desregular diversos mecanismos moleculares e celulares. As propriedades tĆ³xicas da ataxina-2 mutante em conjunto com a formaĆ§Ć£o de agregados, sĆ£o por isso, responsĆ”veis pela disfunĆ§Ć£o e morte de populaƧƵes neuronais especĆ­ficas, nomeadamente as cĆ©lulas de Purkinje. As cĆ©lulas tĆŖm a capacidade de se adaptar a diversos estĆ­mulos intrĆ­nsecos e extrĆ­nsecos, promovendo uma resposta atravĆ©s de diferentes mecanismos que facilitam a adaptaĆ§Ć£o das mesmas a contextos especĆ­ficos, e os neurĆ³nios nĆ£o sĆ£o exceĆ§Ć£o. A resposta celular pode envolver processos de metabolismo de RNA ou atĆ© mesmo mecanismos de manutenĆ§Ć£o da homeostase do proteoma (proteostase). Por um lado, modificaƧƵes pĆ³s-transcricionais sĆ£o reguladas por RNA-binding proteins (RBPs), que desempenham uma funĆ§Ć£o importante no metabolismo de RNAs e, por isso, determinando o seu destino. No que respeita Ć  proteostase celular, esta Ć© executada por proteĆ­nas de diversas classes conhecidas por chaperonas moleculares. As chaperonas desempenham uma aĆ§Ć£o essencial no eficiente enrolamento de proteĆ­nas recĆ©m sintetizadas, na prevenĆ§Ć£o da formaĆ§Ć£o de agregados proteicos derivados da mĆ” conformaĆ§Ć£o de proteĆ­nas, no re-enrolamento de proteĆ­nas e, em Ćŗltima instĆ¢ncia, no direcionamento de proteĆ­nas para vias de degradaĆ§Ć£o. De uma forma geral, as chaperonas sĆ£o proteĆ­nas auxiliares que atuam sobre outras proteĆ­nas com conformaƧƵes anormais, impedindo a sua acumulaĆ§Ć£o e eventual agregaĆ§Ć£o, contribuindo por isso para a manutenĆ§Ć£o da proteostase. Recentemente, diversos estudos em doenƧas neurodegenerativas, incluindo as doenƧas de polyQ evidenciaram a importĆ¢ncia das RBPs e das chaperonas moleculares como potenciais alvos terapĆŖuticos. De facto, nas doenƧas de agregaĆ§Ć£o, nomeadamente na SCA2, a formaĆ§Ć£o de agregados proteicos aberrantes, conduzem Ć  disrupĆ§Ć£o de mĆŗltiplos mecanismos celulares, entre os quais a disfunĆ§Ć£o dos mecanismos de proteostase celular. Estes agregados, sĆ£o tambĆ©m conhecidos por estabelecer interaƧƵes anormais com outras proteĆ­nas que sĆ£o sequestradas das suas funƧƵes normais, o que por fim, pode conduzir Ć  morte neuronal. Deste modo, e sendo a SCA2 uma doenƧa atualmente sem cura, o objetivo principal deste trabalho foi tirar partido das propriedades das RBPs e das chaperonas moleculares, atravĆ©s da modulaĆ§Ć£o de uma RBP/chaperona especĆ­fica, denominada HSPA8, como um possĆ­vel alvo terapĆŖutico na mitigaĆ§Ć£o desta doenƧa. Expectavelmente, o uso da HSPA8 iria modular a proteostase celular, e como resultado preveniria os efeitos negativos da proteĆ­na ataxina-2, conduzindo assim Ć  mitigaĆ§Ć£o da neuropatologia associada Ć  SCA2. De forma a atingir este objetivo, o trabalho aqui apresentado foi dividido, essencialmente, em trĆŖs fases. Na primeira parte deste estudo, fomos averiguar o efeito da sobrexpressĆ£o da HSPA8 num modelo de SCA2 in vitro utilizando cĆ©lulas N2a. Com esta estratĆ©gia, foi possĆ­vel observar que a sobrexpressĆ£o da HSPA8 permitiu a reduĆ§Ć£o do nĆŗmero de cĆ©lulas com agregados quer na forma wild-type (WT), quer em formas mutante da ataxina-2. Contudo, nĆ£o foi possĆ­vel identificar alteraƧƵes nos nĆ­veis da proteĆ­na ataxina-2 mutante. Foi ainda possĆ­vel constatar que a expressĆ£o da HSPA8 nĆ£o produziu um efeito tĆ³xico. Na segunda parte deste trabalho, averiguou-se se os resultados obtidos no modelo in vitro de SCA2 poderiam ser traduzidos para um contexto in vivo mais robusto. Para isso, foi utilizado um modelo lentiviral de SCA2 de murganhos co-injetado no estriado com partĆ­culas lentivirais que codificavam para a ataxina-2 mutante e para a HSPA8, ou como controlo, co-injetado da mesma forma com a ataxina-2 e GFP. O impacto da expressĆ£o da HSPA8 em sinais neuropatolĆ³gicos de SCA2 foi observado e, foi possĆ­vel identificar uma reduĆ§Ć£o no nĆŗmero de agregados de ataxina-2 mutante. Para alĆ©m disso, verificou-se uma reduĆ§Ć£o da perda do marcador neuronal DARPP-32, aquando da expressĆ£o da HSPA8. Adicionalmente, foi possĆ­vel constatar que a HSPA8 nĆ£o induziu alteraƧƵes nos nĆ­veis de proteĆ­na ataxina-2 mutante. Marcadores de neuroinflamaĆ§Ć£o, nomeadamente da ativaĆ§Ć£o da microglia e da ativaĆ§Ć£o de astrĆ³citos, tais como IBA1 e GFAP, respetivamente, foram analisados. Verificou-se que, a expressĆ£o da HSPA8, parecia nĆ£o exacerbar eventos de microgliose e astrogliose. Por Ćŗltimo, avaliou-se possĆ­veis alteraƧƵes nos nĆ­veis basais da HSPA8 num contexto in vivo, utilizado um modelo lentiviral de murganho de SCA2. Assim sendo, os nĆ­veis de expressĆ£o da HSPA8 foram acedidos e nĆ£o foi possĆ­vel detetar alteraƧƵes entre murganhos do modelo lentiviral de SCA2 e murganhos WT. Deste modo, confirmando que a nossa estratĆ©gia terapĆŖutica, se baseava na sobrexpressĆ£o da HSPA8, ao invĆ©s da reposiĆ§Ć£o dos seus nĆ­veis. Em suma, este estudo permitiu perceber que a sobrexpressĆ£o da HSPA8, originou resultados concordantes, quer num contexto in vitro, quer num contexto in vivo de SCA2. A expressĆ£o da HSPA8 permitiu a reduĆ§Ć£o do nĆŗmero de agregados, mas nĆ£o dos nĆ­veis da proteĆ­na ataxina-2 mutante, o que poderĆ” ser sugestivo que de, de facto, a HSPA8 estĆ” a direcionar a proteĆ­na ataxina-2 para mecanismos de restabelecimento da sua conformaĆ§Ć£o, em vez de direcionĆ”-la para as vias de degradaĆ§Ć£o, sugerindo assim, uma recuperaĆ§Ć£o da proteostase celular. Deste modo, o presente estudo realƧa a HSPA8 como um novo potencial alvo terapĆŖutico, nĆ£o apenas com o intuito de tratar sintomaticamente os pacientes de SCA2, mas com a capacidade atrasar ou mesmo curar esta doenƧa debilitante.

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Ataxia espinocerebelosa tipo 2 (sca2) Agregados de ataxina-2 NeurodegeneraĆ§Ć£o Proteostase Chaperonas moleculares Hspa8

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