Modulation of a RBP as potential therapeutic strategy for SCA2

Couto, Filipa Lopes

Publication

Modulation of a RBP as potential therapeutic strategy for SCA2

2023-11-10Master thesis

datacite.subject.fos	Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas	pt_PT
dc.contributor.advisor	Nóbrega, Clévio
dc.contributor.author	Couto, Filipa Lopes
dc.date.accessioned	2024-02-20T11:10:39Z
dc.date.embargo	2026-11-10
dc.date.issued	2023-11-10
dc.description.abstract	Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is one of the nine polyglutamine disease (polyQ), characterized by an abnormally long expansion of the adenine-cytosine-guanine (CAG) trinucleotide within each respective disease-associated gene. PolyQ diseases are dominantly inherited neurodegenerative disorders in which, affected people experience a myriad of highly debilitating motor symptoms. SCA2 arises from a mutation within the coding region of the ATXN2 gene, which is translated into ataxin-2 protein bearing an abnormally long polyQ tract. This mutant protein is prone to aggregate and known to gain toxic function, which is in the basis for disrupting several molecular pathways, which ultimately lead to neuronal death, within specific brain region, including the pons and the cerebellum. Among other, these disrupted pathways might include aberrant RNA metabolism or even loss of cellular proteostasis. Unfortunately, there are no therapeutic options capable of preventing such pathways to became dysregulated, which mean that people affected by SCA2 have no therapies able to cure nor delay the disease progression, ultimately suffering a premature death. To understand whether reestablishing cellular proteostasis could, in fact mitigate SCA2-associated pathology we sought to evaluate the impact of expressing HSPA8, a crucial chaperone involved in the mechanism of proteome homeostasis. In this work we used both in vitro and in vivo approaches to assess whether HSPA8 expression was able prevent SCA2 pathology. We observed that in in vitro models of SCA2 and in an in vivo lentiviral model of this disease, HSPA8 expression was able to both prevent the number of ataxin-2 aggregates and at the same time preserve the neuronal tissue. This work suggests that the expression of HSPA8, a chaperone involved in the mechanism of cellular proteostasis, was able to mitigate SCA2-associated disease hallmarks. Therefore, HPSPA8 could represent a novel therapeutic target for SCA2.	pt_PT
dc.description.abstract	A ataxia espinocerebelosa do tipo 2 (SCA2, do inglês spinocerebellar ataxia type 2) é uma doença neurodegenerativa, autossómica dominante, que se encontra inserida num grupo de nove doenças conhecidas por doenças de poliglutaminas (PolyQ), e que partilham entre si diversos mecanismos patológicos. De entre as diversas formas hereditárias de ataxia, a SCA2 representa a segunda mais prevalente a nível mundial. Esta doença caracteriza-se pela progressão de um conjunto de sintomas debilitantes, sendo a ataxia cerebelosa o sintoma clínico mais predominante. Adicionalmente, os doentes de SCA2 podem também apresentar outros sintomas resultantes da degeneração cerebelosa como a disartria, rigidez muscular, disfagia, assim como outras manifestações não cerebelosas, como movimentos sacádicos oculares lentos, contrações musculares involuntárias e mioclonia. Atualmente, os tratamentos disponíveis são unicamente sintomáticos, não existindo uma terapia eficaz, capaz de atrasar ou parar a progressão da doença. A SCA2 surge como consequência de uma expansão anormal do trinucleótido citosina-adenina-guanina presente na exão 1, na região codificante do gene ATXN2. A expansão anormal de CAGs é conhecida por estar na raiz da patologia inerente à SCA2. Esta mutação conduz à síntese de uma proteína – ataxina-2 – que contém uma sequência de glutaminas anormalmente expandida, que quando, igual ou superior a 32 glutaminas é responsável pela manifestação do fenótipo de SCA2. A proteína ataxina-2, em condições normais, desempenha funções biológicas essenciais, entre as quais modificações pós-transcricionais, regulação da tradução, formação de grânulos de stress, homeostase do cálcio, assim como processos de endocitose e reorganização do citoesqueleto. No entanto, a forma mutante da ataxina-2 tende a agregar, conduzindo à formação de oligómeros e, eventualmente, à acumulação de agregados proteicos insolúveis capazes de gerar toxicidade neuronal e desregular diversos mecanismos moleculares e celulares. As propriedades tóxicas da ataxina-2 mutante em conjunto com a formação de agregados, são por isso, responsáveis pela disfunção e morte de populações neuronais específicas, nomeadamente as células de Purkinje. As células têm a capacidade de se adaptar a diversos estímulos intrínsecos e extrínsecos, promovendo uma resposta através de diferentes mecanismos que facilitam a adaptação das mesmas a contextos específicos, e os neurónios não são exceção. A resposta celular pode envolver processos de metabolismo de RNA ou até mesmo mecanismos de manutenção da homeostase do proteoma (proteostase). Por um lado, modificações pós-transcricionais são reguladas por RNA-binding proteins (RBPs), que desempenham uma função importante no metabolismo de RNAs e, por isso, determinando o seu destino. No que respeita à proteostase celular, esta é executada por proteínas de diversas classes conhecidas por chaperonas moleculares. As chaperonas desempenham uma ação essencial no eficiente enrolamento de proteínas recém sintetizadas, na prevenção da formação de agregados proteicos derivados da má conformação de proteínas, no re-enrolamento de proteínas e, em última instância, no direcionamento de proteínas para vias de degradação. De uma forma geral, as chaperonas são proteínas auxiliares que atuam sobre outras proteínas com conformações anormais, impedindo a sua acumulação e eventual agregação, contribuindo por isso para a manutenção da proteostase. Recentemente, diversos estudos em doenças neurodegenerativas, incluindo as doenças de polyQ evidenciaram a importância das RBPs e das chaperonas moleculares como potenciais alvos terapêuticos. De facto, nas doenças de agregação, nomeadamente na SCA2, a formação de agregados proteicos aberrantes, conduzem à disrupção de múltiplos mecanismos celulares, entre os quais a disfunção dos mecanismos de proteostase celular. Estes agregados, são também conhecidos por estabelecer interações anormais com outras proteínas que são sequestradas das suas funções normais, o que por fim, pode conduzir à morte neuronal. Deste modo, e sendo a SCA2 uma doença atualmente sem cura, o objetivo principal deste trabalho foi tirar partido das propriedades das RBPs e das chaperonas moleculares, através da modulação de uma RBP/chaperona específica, denominada HSPA8, como um possível alvo terapêutico na mitigação desta doença. Expectavelmente, o uso da HSPA8 iria modular a proteostase celular, e como resultado preveniria os efeitos negativos da proteína ataxina-2, conduzindo assim à mitigação da neuropatologia associada à SCA2. De forma a atingir este objetivo, o trabalho aqui apresentado foi dividido, essencialmente, em três fases. Na primeira parte deste estudo, fomos averiguar o efeito da sobrexpressão da HSPA8 num modelo de SCA2 in vitro utilizando células N2a. Com esta estratégia, foi possível observar que a sobrexpressão da HSPA8 permitiu a redução do número de células com agregados quer na forma wild-type (WT), quer em formas mutante da ataxina-2. Contudo, não foi possível identificar alterações nos níveis da proteína ataxina-2 mutante. Foi ainda possível constatar que a expressão da HSPA8 não produziu um efeito tóxico. Na segunda parte deste trabalho, averiguou-se se os resultados obtidos no modelo in vitro de SCA2 poderiam ser traduzidos para um contexto in vivo mais robusto. Para isso, foi utilizado um modelo lentiviral de SCA2 de murganhos co-injetado no estriado com partículas lentivirais que codificavam para a ataxina-2 mutante e para a HSPA8, ou como controlo, co-injetado da mesma forma com a ataxina-2 e GFP. O impacto da expressão da HSPA8 em sinais neuropatológicos de SCA2 foi observado e, foi possível identificar uma redução no número de agregados de ataxina-2 mutante. Para além disso, verificou-se uma redução da perda do marcador neuronal DARPP-32, aquando da expressão da HSPA8. Adicionalmente, foi possível constatar que a HSPA8 não induziu alterações nos níveis de proteína ataxina-2 mutante. Marcadores de neuroinflamação, nomeadamente da ativação da microglia e da ativação de astrócitos, tais como IBA1 e GFAP, respetivamente, foram analisados. Verificou-se que, a expressão da HSPA8, parecia não exacerbar eventos de microgliose e astrogliose. Por último, avaliou-se possíveis alterações nos níveis basais da HSPA8 num contexto in vivo, utilizado um modelo lentiviral de murganho de SCA2. Assim sendo, os níveis de expressão da HSPA8 foram acedidos e não foi possível detetar alterações entre murganhos do modelo lentiviral de SCA2 e murganhos WT. Deste modo, confirmando que a nossa estratégia terapêutica, se baseava na sobrexpressão da HSPA8, ao invés da reposição dos seus níveis. Em suma, este estudo permitiu perceber que a sobrexpressão da HSPA8, originou resultados concordantes, quer num contexto in vitro, quer num contexto in vivo de SCA2. A expressão da HSPA8 permitiu a redução do número de agregados, mas não dos níveis da proteína ataxina-2 mutante, o que poderá ser sugestivo que de, de facto, a HSPA8 está a direcionar a proteína ataxina-2 para mecanismos de restabelecimento da sua conformação, em vez de direcioná-la para as vias de degradação, sugerindo assim, uma recuperação da proteostase celular. Deste modo, o presente estudo realça a HSPA8 como um novo potencial alvo terapêutico, não apenas com o intuito de tratar sintomaticamente os pacientes de SCA2, mas com a capacidade atrasar ou mesmo curar esta doença debilitante.	pt_PT
dc.identifier.tid	203532376	pt_PT
dc.identifier.uri	http://hdl.handle.net/10400.1/20418
dc.language.iso	eng	pt_PT
dc.rights.uri	http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/	pt_PT
dc.subject	Ataxia espinocerebelosa tipo 2 (sca2)	pt_PT
dc.subject	Agregados de ataxina-2	pt_PT
dc.subject	Neurodegeneração	pt_PT
dc.subject	Proteostase	pt_PT
dc.subject	Chaperonas moleculares	pt_PT
dc.subject	Hspa8	pt_PT
dc.title	Modulation of a RBP as potential therapeutic strategy for SCA2	pt_PT
dc.type	master thesis
dspace.entity.type	Publication
rcaap.rights	embargoedAccess	pt_PT
rcaap.type	masterThesis	pt_PT
thesis.degree.grantor	Universidade do Algarve. Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas
thesis.degree.level	Mestre
thesis.degree.name	Mestrado em Ciências Biomédicas - Mecanismos de Doença	pt_PT