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Molecular and functional analysis of DAND5 in human Congenital Heart Disease (CHD)
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
The majority of congenital heart disease (CHD) is sporadic, with a minority of
cases associated with a known genetic abnormality. Combinations of geneticenvironmental
factors are implicated in the etiology of the disease. Recently,
several studies, using mostly animal models, unraveled that perturbations in the
molecular processes that precede the beginning of heart development might
also be at the origin of CHD. In fact, some of the most complex CHDs are found
associated with laterality defects, a disorder resulting from abnormal Left-Right
axis formation. In our laboratory, the identified mouse Cerberus-like2 (Cerl2 –
human DAND5), a protein that inhibit Nodal signaling, prompt us to study
cardiac and laterality diseases, since the generated Cerl2 KO mice display a
wide range of laterality defects and CHD. Considering the high conservation of
genetic pathways regulating cardiac development in mouse and human, the
main objective of the present thesis was the study of human genes involved in
the Nodal pathway, focusing mostly in DAND5, in a CHD and/or laterality
defects patients cohort. The sequence analysis of DAND5 revealed two patients
displaying the same p.R152H variant, resulting in a substantial decreased in the
function of the protein. We propose that p.R152H acts as a risk allele for CHD
and/or laterality defects. In addition, we found two alterations in NODAL, two
alterations in PITX2C and one alteration in CFC1. We hypothesized that the
NODAL p.H165R variant can act as a common modifier and the intronic
variants in NODAL and PITX2C might cause alterations in the splicing pattern of
the mRNA molecules. Moreover, we generated patient-specific iPSCs to
understand the molecular mechanisms of disease behind the DAND5
nucleotide variant. Although we cannot make a clearly genotype-phenotype
correlation, the variants here identified probably increase the disease
susceptibility due to the resulting abnormal Nodal signaling. Because most of
the patients presented more than one alteration, the cumulative effect of each
variant within the pathway seems to enhance even more these risk. Therefore,
the imbalance in dosage-sensitive Nodal signaling is a common denominator for
laterality defects and associated CHDs.
Uma das questões fulcrais da biologia do desenvolvimento continua a ser como é que uma única célula, o oócito fecundado, se desenvolve num ser tão complexo e especializado, com os tecidos e órgãos diferenciados e organizados em torno de três eixos, o anterior-posterior (AP), dorso-ventral (DV) e esquerdo-direito (LR). De um modo geral, o desenvolvimento embrionário humano pode ser dividido em três períodos: o primeiro, chamado de período zigótico, inicia-se com a fusão dos gametas masculino e feminino, formação do zigoto e termina com a implantação do blastocisto na parede do útero duas semanas após a fecundação. Durante o segundo período, ou período embrionário, que vai desde a terceira até à oitava semana de gestação, ocorre a gastrulação, com a formação e diferenciação dos folhetos embrionários (ectoderme, mesoderme e endoderme), e a formação dos órgãos e sistemas fisiológicos. O ultimo período, chamado fetal, vai desde o terceiro mês de gestação até ao nascimento e é caracterizado pelo crescimento do embrião, maturação e funcionalização das estruturas e órgãos. Durante o desenvolvimento do embrião, o coração é o primeiro órgão interno a ser formado e a tornar-se funcional de modo a bombear sangue por volta das três semanas de gestação, suprindo as necessidades do embrião e garantindo a sua sobrevivência. Na maioria dos vertebrados o desenvolvimento cardíaco segue o mesmo padrão de formação. O coração forma-se a partir de duas regiões cardíacas bilaterais que advêm de uma região progenitora comum na gastrulação, a mesoderme cardíaca. A mesoderme cardíaca recebe informação posicional dos três eixos embrionários, porém o efeito do eixo Esquerda-Direita (ED) tem recebido particular atenção. Os dois “pools” bilaterais de células precursoras cardíacas mesodermais migram para a linha média onde se juntam e dão origem ao crescente cardíaco. Este crescente cardíaco vai formar posteriormente um tubo cardíaco linear primordial. De seguida, este tubo alonga e sofre um processo de “looping” para a direita levando à formação dos ventrículos e aurículas. Subsequentemente, ocorre a diferenciação, especialização e septação das quatro camaras cardíacas e válvulas proporcionando as paredes necessárias para a separação física da circulação sistémica e pulmonar de sangue. Por último a formação do sistema de condução cardíaco e maturação dos cardiomiócitos, culminam na formação de um coração inteiramente funcional. As doenças cardíacas congénitas (DCC) são a manifestação clínica de problemas durante o desenvolvimento embrionário do coração. Esta doença é a forma mais comum de defeito à nascença, ocorrendo em cerca de 8 em 1000 nados vivos, bem como a principal causa não-infeciosa de morte no primeiro ano de vida. Na maioria dos casos (80%), esta doença tem origem desconhecida e manifesta-se isoladamente em doentes não sindrómicos e não seguindo os padrões de hereditariedade definidos por Mendel, sendo considerada uma doença complexa com origem multifatorial. Esta complexidade advém do facto de a doença em muitos casos se apresentar geneticamente heterogenica, com penetrância reduzida e expressividade genética variável. Para além disso, fatores de risco ambientais foram também identificados como contribuído para o risco de desenvolver a doença. Nos dias de hoje, um modelo envolvendo tanto fatores genéticos como a interação genes-ambiente, é a explicação mais plausível para as altas frequências verificadas para a doença cardíaca congénita. Nos últimos anos, vários esforços foram feitos de modo a se compreender os mecanismos moleculares que levam a uma má formação do coração. Estes estudos, usando principalmente animais modelo e genética molecular humana, da morfogénese do coração e dos primeiros passos da determinação do eixo de simetria esquerdo-direito durante a embriogénese, indicam que na maioria dos casos de distúrbios de lateralidade é observada uma malformação cardíaca complexa, sugerindo que as DCC podem dever-se a defeitos de lateralidade na morfogénese do coração. Uma das redes regulatórias por detrás do estabelecimento do eixo esquerdodireito é a via de sinalização Nodal, um fator de crescimento da família TGF-b, que é expresso assimetricamente do lado esquerdo do nó e placa lateral esquerda da mesoderme de ratinho. Os fenótipos cardíacos de ratinhos geneticamente modificados para desativar a sinalização de nodal ou a sua regulação, demonstraram que o desenvolvimento cardíaco depende vivamente do estabelecimento do eixo E-D embrionário. Para além disso, foram identificadas variantes genéticas em genes envolvidos na via de sinalização Nodal em doentes com DCC. O nosso laboratório identificou um membro da família Cerberus/DAN, o gene Cerberus-like2 (Cerl2), que é assimetricamente expresso no lado direito do nó em ratinho. O gene Cerl2 codifica para uma proteína secretada capaz de se liga diretamente a Nodal, inibindo a sua via de sinalização. Na presença de Cerl2 a atividade da via de sinalização Nodal restringe-se apenas ao lado esquerdo do embrião, o que culmina com uma morfogénese normal dos órgãos do abdómem. Ratinhos knock-out para o gene Cerl2, em que o gene Nodal passa a poder ser expresso e induzir a sua cascata de sinalização em ambos os lados da placa lateral da mesoderme, revelaram uma ampla gama de defeitos de lateralidade - situs inversus, isomerismos e heterotaxia - e malformações cardíacas - formação incompleta das aurículas, defeitos no septo ventricular, falha na rotação das principais artérias (transposição das grandes artérias, ventrículo direito de dupla saída), looping cardíaco anormal (randomizado), posicionamento do ápex cardíaco e hipertrofia ventricular - o que nos levou a suspeitar que alterações neste gene poderiam estar associadas a doenças de lateralidade e/ou casos isolados de doenças cardíacas congénitas. Dado que as vias genéticas que regulam o desenvolvimento cardíaco em ratinhos e humanos são conservadas, o principal objetivo desta tese foi o estudo de alguns dos genes homólogos humanos envolvidos na via de sinalização Nodal, com principal foco no gene DAND5, homólogo humano de Cerl2, mapeado no cromossoma 19, região 19p13.2, mas também verificando a existência de variantes nos genes NODAL, PITX2C e CFC1 numa cohort de doentes com defeitos cardíacos congénitos com origem em perturbações do eixo esquerdo-direito. A análise dos resultados da sequenciação de DNA do gene DAND5 permitiunos identificar dois doentes com a mesma variação. Clinicamente, um dos doentes apresenta um fenótipo de defeito no septo ventricular com aorta conectada aos dois ventrículos, atresia pulmonar e isomerismo esquerdo. O outro doente apresenta um caso extremo de tetralogia de Fallot (defeito no septo ventricular com aorta conectada aos dois ventrículos, hipertrofia do ventrículo esquerdo e atresia pulmonar). A variante, identificada nos dois doentes como heterozigótica, leva à substituição de um nucleótido guanina por uma adenina na posição 455 do exão 2, resultando na substituição de um aminoácido arginina por uma histidina (p.R152H) numa região altamente conservada e funcionalmente importante da proteína DAND5. De modo a entendermos o potencial efeito da alteração p.R152H na proteína DAND5, fizemos um estudo in silico recorrendo a vários programas bioinformáticos. Os resultados dessas predições foram inconclusivos uma vez que 3 programas apontam para um possível efeito nefasto enquanto que outro programa sugere que a variante não tem qualquer efeito na proteína. Para clarificarmos a função desta proteína variante, avaliámos o seu efeito na regulação da via de sinalização Nodal recorrendo a um ensaio funcional de luciferase. O resultado obtido mostra uma diminuição substancial da função da proteína mutante comparada com a proteína wild-type. Embora os fenótipos dos doentes sejam muito semelhantes, não podemos fazer uma clara correlação do genótipo com o fenótipo pois a variante c.455G>A foi reportada em bases de dados publicas como variante de nucleótido único (rs45513495). Além disso, a mãe de um dos doentes é portadora da variante sem apresentar indícios de doença, sugerindo uma penetrância incompleta, expressividade genética variável ou o efeito de fatores ambientais. Estas observações estão de acordo com a complexidade das doenças cardíacas congénitas e/ou defeitos de lateralidade e podem refletir a acção de variantes modificadoras ou outras variantes genéticas na via de sinalização que podem exacerbar ou atenuar o efeito da variante p.R152H na proteína DAND5 e nos fenótipos dos doentes. Portanto, nós propomos que esta variação no gene DAND5 pode ser um alelo de risco para o desenvolvimento de DCC e/ou defeitos de lateralidade. Por esta razão, decidimos levar a cabo uma busca de possíveis alterações em genes que fazem parte desta cascata Nodal. Foram assim identificadas uma nova alteração na zona codificante do gene CFC1, sem efeito funcional aparente, e quatro polimorfismos, um na zona codificante e outro no intrão do gene NODAL e dois na zona não codificante do gene PITX2C em doentes com uma vasta gama de defeitos. Tendo em conta a análise levada a cabo por um programa bioinformático que permite analisar se alterações genéticas podem afetar o processo de splicing, nós verificamos que de facto, as variantes genómicas encontradas fora das zonas codificantes dos genes NODAL e PITX2C podem resultar em moléculas de RNA mensageiro anormais, principalmente devido à criação ou disrupção de locais para a ligação da maquinaria de splicing. Quanto à variante na zona codificante do gene NODAL, esta encontra-se no exão 2, e leva à substituição do aminoácido Histidina por uma Arginina na posição 165 (p.H165R). Esta variante já tinha sido reportada em dois estudos de 2008/2009 nos quais os autores verificaram, recorrendo a um ensaio funcional de lucifarese, que a variante leva à redução da atividade da proteína NODAL e parece atuar como variante modificadora e como fator de risco quando associada a outras possíbeis alterações em genes da via Nodal, com os quais este normalmente interage. Para além disto, e com o objetivo de modelar a doença e estudar os mecanismos moleculares por de trás de uma simples variação num nucleótido, geramos células estaminais induzidas de um dos doentes com a variante no gene DAND5. Estas células foram caracterizadas, apresentado uma morfologia, expressão de marcadores pluripotentes e cariotipo normais. Em conclusão, embora não possamos fazer uma correlação dos genótipofenótipo, nem classificar as alterações identificadas neste estudo como alelos associadas a doença por si, estas variantes, podem, no entanto, aumentar a suscetibilidade para o desenvolvimento de DCC e/ou defeitos de lateralidade. Uma vez que a maioria dos doentes apresenta mais do que uma das variantes no seu genoma, o efeito cumulativo de cada variante na via parece aumentar ainda mais o risco para desenvolver doença. Portanto, o desequilíbrio dos níveis adequados da via de sinalização Nodal, em ambos os lados da placa lateral da mesoderme, devido a uma ou várias variantes nos seus componentes, é um denominador comum para defeitos de lateralidade e/ou doenças cardíacas congénitas.
Uma das questões fulcrais da biologia do desenvolvimento continua a ser como é que uma única célula, o oócito fecundado, se desenvolve num ser tão complexo e especializado, com os tecidos e órgãos diferenciados e organizados em torno de três eixos, o anterior-posterior (AP), dorso-ventral (DV) e esquerdo-direito (LR). De um modo geral, o desenvolvimento embrionário humano pode ser dividido em três períodos: o primeiro, chamado de período zigótico, inicia-se com a fusão dos gametas masculino e feminino, formação do zigoto e termina com a implantação do blastocisto na parede do útero duas semanas após a fecundação. Durante o segundo período, ou período embrionário, que vai desde a terceira até à oitava semana de gestação, ocorre a gastrulação, com a formação e diferenciação dos folhetos embrionários (ectoderme, mesoderme e endoderme), e a formação dos órgãos e sistemas fisiológicos. O ultimo período, chamado fetal, vai desde o terceiro mês de gestação até ao nascimento e é caracterizado pelo crescimento do embrião, maturação e funcionalização das estruturas e órgãos. Durante o desenvolvimento do embrião, o coração é o primeiro órgão interno a ser formado e a tornar-se funcional de modo a bombear sangue por volta das três semanas de gestação, suprindo as necessidades do embrião e garantindo a sua sobrevivência. Na maioria dos vertebrados o desenvolvimento cardíaco segue o mesmo padrão de formação. O coração forma-se a partir de duas regiões cardíacas bilaterais que advêm de uma região progenitora comum na gastrulação, a mesoderme cardíaca. A mesoderme cardíaca recebe informação posicional dos três eixos embrionários, porém o efeito do eixo Esquerda-Direita (ED) tem recebido particular atenção. Os dois “pools” bilaterais de células precursoras cardíacas mesodermais migram para a linha média onde se juntam e dão origem ao crescente cardíaco. Este crescente cardíaco vai formar posteriormente um tubo cardíaco linear primordial. De seguida, este tubo alonga e sofre um processo de “looping” para a direita levando à formação dos ventrículos e aurículas. Subsequentemente, ocorre a diferenciação, especialização e septação das quatro camaras cardíacas e válvulas proporcionando as paredes necessárias para a separação física da circulação sistémica e pulmonar de sangue. Por último a formação do sistema de condução cardíaco e maturação dos cardiomiócitos, culminam na formação de um coração inteiramente funcional. As doenças cardíacas congénitas (DCC) são a manifestação clínica de problemas durante o desenvolvimento embrionário do coração. Esta doença é a forma mais comum de defeito à nascença, ocorrendo em cerca de 8 em 1000 nados vivos, bem como a principal causa não-infeciosa de morte no primeiro ano de vida. Na maioria dos casos (80%), esta doença tem origem desconhecida e manifesta-se isoladamente em doentes não sindrómicos e não seguindo os padrões de hereditariedade definidos por Mendel, sendo considerada uma doença complexa com origem multifatorial. Esta complexidade advém do facto de a doença em muitos casos se apresentar geneticamente heterogenica, com penetrância reduzida e expressividade genética variável. Para além disso, fatores de risco ambientais foram também identificados como contribuído para o risco de desenvolver a doença. Nos dias de hoje, um modelo envolvendo tanto fatores genéticos como a interação genes-ambiente, é a explicação mais plausível para as altas frequências verificadas para a doença cardíaca congénita. Nos últimos anos, vários esforços foram feitos de modo a se compreender os mecanismos moleculares que levam a uma má formação do coração. Estes estudos, usando principalmente animais modelo e genética molecular humana, da morfogénese do coração e dos primeiros passos da determinação do eixo de simetria esquerdo-direito durante a embriogénese, indicam que na maioria dos casos de distúrbios de lateralidade é observada uma malformação cardíaca complexa, sugerindo que as DCC podem dever-se a defeitos de lateralidade na morfogénese do coração. Uma das redes regulatórias por detrás do estabelecimento do eixo esquerdodireito é a via de sinalização Nodal, um fator de crescimento da família TGF-b, que é expresso assimetricamente do lado esquerdo do nó e placa lateral esquerda da mesoderme de ratinho. Os fenótipos cardíacos de ratinhos geneticamente modificados para desativar a sinalização de nodal ou a sua regulação, demonstraram que o desenvolvimento cardíaco depende vivamente do estabelecimento do eixo E-D embrionário. Para além disso, foram identificadas variantes genéticas em genes envolvidos na via de sinalização Nodal em doentes com DCC. O nosso laboratório identificou um membro da família Cerberus/DAN, o gene Cerberus-like2 (Cerl2), que é assimetricamente expresso no lado direito do nó em ratinho. O gene Cerl2 codifica para uma proteína secretada capaz de se liga diretamente a Nodal, inibindo a sua via de sinalização. Na presença de Cerl2 a atividade da via de sinalização Nodal restringe-se apenas ao lado esquerdo do embrião, o que culmina com uma morfogénese normal dos órgãos do abdómem. Ratinhos knock-out para o gene Cerl2, em que o gene Nodal passa a poder ser expresso e induzir a sua cascata de sinalização em ambos os lados da placa lateral da mesoderme, revelaram uma ampla gama de defeitos de lateralidade - situs inversus, isomerismos e heterotaxia - e malformações cardíacas - formação incompleta das aurículas, defeitos no septo ventricular, falha na rotação das principais artérias (transposição das grandes artérias, ventrículo direito de dupla saída), looping cardíaco anormal (randomizado), posicionamento do ápex cardíaco e hipertrofia ventricular - o que nos levou a suspeitar que alterações neste gene poderiam estar associadas a doenças de lateralidade e/ou casos isolados de doenças cardíacas congénitas. Dado que as vias genéticas que regulam o desenvolvimento cardíaco em ratinhos e humanos são conservadas, o principal objetivo desta tese foi o estudo de alguns dos genes homólogos humanos envolvidos na via de sinalização Nodal, com principal foco no gene DAND5, homólogo humano de Cerl2, mapeado no cromossoma 19, região 19p13.2, mas também verificando a existência de variantes nos genes NODAL, PITX2C e CFC1 numa cohort de doentes com defeitos cardíacos congénitos com origem em perturbações do eixo esquerdo-direito. A análise dos resultados da sequenciação de DNA do gene DAND5 permitiunos identificar dois doentes com a mesma variação. Clinicamente, um dos doentes apresenta um fenótipo de defeito no septo ventricular com aorta conectada aos dois ventrículos, atresia pulmonar e isomerismo esquerdo. O outro doente apresenta um caso extremo de tetralogia de Fallot (defeito no septo ventricular com aorta conectada aos dois ventrículos, hipertrofia do ventrículo esquerdo e atresia pulmonar). A variante, identificada nos dois doentes como heterozigótica, leva à substituição de um nucleótido guanina por uma adenina na posição 455 do exão 2, resultando na substituição de um aminoácido arginina por uma histidina (p.R152H) numa região altamente conservada e funcionalmente importante da proteína DAND5. De modo a entendermos o potencial efeito da alteração p.R152H na proteína DAND5, fizemos um estudo in silico recorrendo a vários programas bioinformáticos. Os resultados dessas predições foram inconclusivos uma vez que 3 programas apontam para um possível efeito nefasto enquanto que outro programa sugere que a variante não tem qualquer efeito na proteína. Para clarificarmos a função desta proteína variante, avaliámos o seu efeito na regulação da via de sinalização Nodal recorrendo a um ensaio funcional de luciferase. O resultado obtido mostra uma diminuição substancial da função da proteína mutante comparada com a proteína wild-type. Embora os fenótipos dos doentes sejam muito semelhantes, não podemos fazer uma clara correlação do genótipo com o fenótipo pois a variante c.455G>A foi reportada em bases de dados publicas como variante de nucleótido único (rs45513495). Além disso, a mãe de um dos doentes é portadora da variante sem apresentar indícios de doença, sugerindo uma penetrância incompleta, expressividade genética variável ou o efeito de fatores ambientais. Estas observações estão de acordo com a complexidade das doenças cardíacas congénitas e/ou defeitos de lateralidade e podem refletir a acção de variantes modificadoras ou outras variantes genéticas na via de sinalização que podem exacerbar ou atenuar o efeito da variante p.R152H na proteína DAND5 e nos fenótipos dos doentes. Portanto, nós propomos que esta variação no gene DAND5 pode ser um alelo de risco para o desenvolvimento de DCC e/ou defeitos de lateralidade. Por esta razão, decidimos levar a cabo uma busca de possíveis alterações em genes que fazem parte desta cascata Nodal. Foram assim identificadas uma nova alteração na zona codificante do gene CFC1, sem efeito funcional aparente, e quatro polimorfismos, um na zona codificante e outro no intrão do gene NODAL e dois na zona não codificante do gene PITX2C em doentes com uma vasta gama de defeitos. Tendo em conta a análise levada a cabo por um programa bioinformático que permite analisar se alterações genéticas podem afetar o processo de splicing, nós verificamos que de facto, as variantes genómicas encontradas fora das zonas codificantes dos genes NODAL e PITX2C podem resultar em moléculas de RNA mensageiro anormais, principalmente devido à criação ou disrupção de locais para a ligação da maquinaria de splicing. Quanto à variante na zona codificante do gene NODAL, esta encontra-se no exão 2, e leva à substituição do aminoácido Histidina por uma Arginina na posição 165 (p.H165R). Esta variante já tinha sido reportada em dois estudos de 2008/2009 nos quais os autores verificaram, recorrendo a um ensaio funcional de lucifarese, que a variante leva à redução da atividade da proteína NODAL e parece atuar como variante modificadora e como fator de risco quando associada a outras possíbeis alterações em genes da via Nodal, com os quais este normalmente interage. Para além disto, e com o objetivo de modelar a doença e estudar os mecanismos moleculares por de trás de uma simples variação num nucleótido, geramos células estaminais induzidas de um dos doentes com a variante no gene DAND5. Estas células foram caracterizadas, apresentado uma morfologia, expressão de marcadores pluripotentes e cariotipo normais. Em conclusão, embora não possamos fazer uma correlação dos genótipofenótipo, nem classificar as alterações identificadas neste estudo como alelos associadas a doença por si, estas variantes, podem, no entanto, aumentar a suscetibilidade para o desenvolvimento de DCC e/ou defeitos de lateralidade. Uma vez que a maioria dos doentes apresenta mais do que uma das variantes no seu genoma, o efeito cumulativo de cada variante na via parece aumentar ainda mais o risco para desenvolver doença. Portanto, o desequilíbrio dos níveis adequados da via de sinalização Nodal, em ambos os lados da placa lateral da mesoderme, devido a uma ou várias variantes nos seus componentes, é um denominador comum para defeitos de lateralidade e/ou doenças cardíacas congénitas.
Description
Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2017
Keywords
DAND5 Doenças cardíacas congénitas Defeitos de lateralidade Via de sinalização Nodal Variantes alélicas Modelação de doença Células estaminais induzidas