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Publication
Exploring angiogenesis and cardiomyocyte differentiation in left ventricular noncompaction using patient derived hiPSC
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Left ventricular noncompaction (LVNC), is a rare cardiomyopathy characterized by a spongy myocardial structure, hyper-trabeculation and intra-trabecular recesses, resulting from failure of normal embryonic compaction of the myocardium. The prevalence of LVNC varies globally, between 9.5% in paediatric age and 0.05-0.25% in the general population. Multiple genetic mutations are associated with LVNC, affecting sarcomeric, cytoskeletal and mitochondrial functions. This study investigates the genetic mechanisms underlaying LVNC, focusing on mutations involved in heart diseases and their impact in cardiomyocyte differentiation and angiogenesis, with a special focus on ZSCAN10, SCN10A and VE-PTP, found mutated in the patient’s cells used in this study. Cardiomyocytes were differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from a LVNC patient and a 1st degree healthy relative. Gene relative expression analysis of samples collected during cardiomyocyte differentiation, highlighted significant differences on in key genes, such as GATA4, ISL1, SOX17, KDR, VE-PTP, VEGFA, TNNT2 and NKX2.5 in patients derived cells compared to control cells. Among those, GATA4, ISL1 and NKX2.5, which were previously showed to cooperate for the differentiation and proliferation of cardiomyocytes, presented a significantly lower expression. SOX17, KDR and VEGFA have functions in cardiac vascularization, and the expression of SOX17 was higher in patient’s cells, while in the same conditions KDR and VEGFA were decreased at critical time points for endothelial cells differentiation. Thus, the expression of these genes, crucial for cardiomyocyte development and angiogenesis, were markedly altered in LVNC-derived cells compared to control cells. A Tube formation assay using endothelial cells from both LVNC-derived and control cells, to assess their ability to form capillary like structures. Remarkable differences were observed, with patient cells showing a delayed and an impaired tube formation, and a reduced vascular network complexity. Overall, our results argue that novel genetic and cellular mechanisms might be altered in the LVNC patient cells analysed.
O desenvolvimento embrionário do coração é um processo delicado que envolve várias vias de sinalização, quando perturbadas podem originar cardiomiopatias graves e fatais para o feto. Os defeitos congénitos cardíacos apresentam uma grande variedade de fenótipos e são a principal causa de morte infantil. A LVNC é uma malformação cardíaca congénita caracterizada pela presença de trabéculas, recessos profundos em uma camada endocardial fina. Pode ser encontrada isolada ou associada a outras cardiomiopatias, com sintomatologia variadas; em crianças pode ser extremamente grave podendo estar associado a deficiências cognitivas e atrasos no desenvolvimento. O tratamento evoluiu bastante não apresentando uma mortalidade tão elevada, sendo possível através de procedimentos cirúrgicos corrigir a malformação ou transplante cardíaco. Em pacientes, em que o diagnostico foi realizado na idade adulta, muitos são assintomáticos enquanto outros apresentam arritmias, taquicardias e tem um risco acrescido de morte por paragem cardíaca. Além disso, foi detetado em atletas de alta competição e em mulheres grávidas, mas foi observado que pode ser transiente em o fenótipo, a presença de trabéculas, desvanece. A sua origem não é consensual, mas está descrita uma teoria génica que descreve que entre a 2ª e 3ª semana do desenvolvimento embrionário o coração, durante a formação dos ventrículos, em que o coração está a formar as trabéculas que vão compactar e formar o miocárdio, o que, segundo a teoria congénita é interrompido. Como existem tantos fenótipos diferentes, não apresenta uma única causa genética, mas que foram descobertos vários genes mutados que podem influenciar o seu aparecimento. Os genes descobertos estão responsáveis por funções sarcoméricas, de fatores de transcrição, com função mitocondrial e de proteínas do citoesqueleto. Neste estudo foram usadas células pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) de um paciente com LVNC e de um familiar saudável de 1º grau. Foram geradas células endoteliais e cardiomiocitos a partir das hiPSCs. Os cardiomiocitos foram gerados através da ativação da via WNT com a estimulação sequencial das células com CHIR99021 e a sua inativação com a suplementação de IWP2. A partir do sétimo dia de diferenciação os cardiomiocitos derivados das hiPSCs de paciente e controlo, que adquirem uma função contrátil autónoma, apresentavam diferenças observáveis. Principalmente no espaço temporal do aparecimento da contração espontânea e da área observável com batimento. O batimento espontâneo nas células de paciente mostrava um atraso de 2-3 dias, comparada com as células controlo. E ao fim de 14 dias de diferenciação foram observadas várias diferenças incluindo a área com batimento cardíaco e as estruturas formadas. Enquanto os cardiomiocitos controlo apresentavam uma área extensa e estruturas como uma rede, as células de paciente apresentavam pequenas áreas com batimento espontâneo e estruturas redondas. Foram realizadas recolhas de amostras celulares em diferentes estados de diferenciação, ao dia 1, 3, 5 e 8. Com as amostras foram realizados RT-PCR, para verificar se existiriam diferenças na expressão de mRNA dos genes NANOG, SOX2, OCT4, MESP1/2, BRACHYURY, VE-PTP, SNC5A, SCN10A, TNNT2, ZSCAN10, NKX 2.5, ISL1, KDR, GATA4, VEGFA, SOX17, NFACT1 e NFACT2. Neste ensaio foi verificada a existência de diferenças significativas na expressão de genes ligados à formação dos vasos sanguíneos que irrigam o coração. Nomeadamente, o VE-PTP, VEGFA, SOX17 e KDR. SOX17 apresentava uma expressão mais elevada nas células de paciente. Enquanto o mRNA relativo de KDR, VEGFA e estavam diminuídos nas células derivadas do paciente, ao dia 5. KDR é um receptor de VEGFA. KDR e VEGFA são dois genes essenciais para a formação de vasos sanguíneos. Genes ligados à diferenciação e proliferação de cardiomiocitos também se encontravam significativamente alterados (GATA4, NKX2.5, ISL1 e TNNT2). GAT4 forma um complexo com NKX2.5, que se vai ligar a regiões especificas de ISL1 para promover a expressão de genes para cardiomiocitos atriais e ventriculares. Se a sua expressão está diminuída significativamente, a diferenciação dos progenitores cardíacos poderá estar comprometida. As células endoteliais foram derivadas com a utilização de um kit comercial, o fenótipo das células foi confirmado por citometria de fluxo e imunofluorescência, com a luminescência do anticorpo superficial CD31. O ensaio de formação de tubos é um ensaio utilizado para verificar a capacidade angiogénicas das células. E neste estudo foi utilizado para verificar se existiriam diferenças nas capacidades das células endoteliais derivadas das hiPSCs do paciente com LVNC em formar tubos em comparação com as células do controlo saudável. Principalmente, por um dos genes mutados estar diretamente relacionado com a angiogénese de vasos sanguíneos cardíacos, o gene VE-PTP. As variáveis observadas foram o comprimento e tamanho das malhas, os nodos, os segmentos, ramificações das extensões e existência de segmentos não conectados e extremidades. O ensaio de formação de tubos foi realizado três densidades celulares diferentes (5 000; 10 000 e 15 000 células) e a formação observada até às 16 horas (h) (1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 16h). As imagens foram avaliadas através da extensão do Image J, “Angiogenesis Analyser”, e analisado o Fold Change das variáveis (das células paciente sobre as células controlo saudável). Foram verificadas mais diferenças significativas nas horas 3 e 4, com a verificação da presença de menos segmentos e mais curtos e verificou-se maior número de segmentos isolados, verifica-se uma maior dificuldade para as células formarem ligações. Presença de menos malhas e mais pequenas. O número de ramificações e o comprimento também foi menor. Estes resultados representam a capacidade angiogénicas das células do paciente, em que se pode verificar uma maior dificuldade para as células endoteliais do paciente se conectarem e formarem vasos e as redes interconectadas de vasos sanguíneos para uma boa irrigação sanguínea do coração. No geral, o resultado obtido na formação de tubos confirmou que algum mecanismo ligado á formação das células endoteliais ou relacionado com as junções aderentes, poderão estar comprometidos. Em específico, as células endoteliais derivadas das células do paciente apresentarem uma organização mais deficiente em comparação com as células controle. E os genes relacionados com a angiogénese estão significativamente diminuídos comprovam a existência de um mecanismo angiogénico mutado. Futuros testes a proteínas expressas por estes genes, que poderão estar alteradas, são necessários para confirmar o fenótipo.
O desenvolvimento embrionário do coração é um processo delicado que envolve várias vias de sinalização, quando perturbadas podem originar cardiomiopatias graves e fatais para o feto. Os defeitos congénitos cardíacos apresentam uma grande variedade de fenótipos e são a principal causa de morte infantil. A LVNC é uma malformação cardíaca congénita caracterizada pela presença de trabéculas, recessos profundos em uma camada endocardial fina. Pode ser encontrada isolada ou associada a outras cardiomiopatias, com sintomatologia variadas; em crianças pode ser extremamente grave podendo estar associado a deficiências cognitivas e atrasos no desenvolvimento. O tratamento evoluiu bastante não apresentando uma mortalidade tão elevada, sendo possível através de procedimentos cirúrgicos corrigir a malformação ou transplante cardíaco. Em pacientes, em que o diagnostico foi realizado na idade adulta, muitos são assintomáticos enquanto outros apresentam arritmias, taquicardias e tem um risco acrescido de morte por paragem cardíaca. Além disso, foi detetado em atletas de alta competição e em mulheres grávidas, mas foi observado que pode ser transiente em o fenótipo, a presença de trabéculas, desvanece. A sua origem não é consensual, mas está descrita uma teoria génica que descreve que entre a 2ª e 3ª semana do desenvolvimento embrionário o coração, durante a formação dos ventrículos, em que o coração está a formar as trabéculas que vão compactar e formar o miocárdio, o que, segundo a teoria congénita é interrompido. Como existem tantos fenótipos diferentes, não apresenta uma única causa genética, mas que foram descobertos vários genes mutados que podem influenciar o seu aparecimento. Os genes descobertos estão responsáveis por funções sarcoméricas, de fatores de transcrição, com função mitocondrial e de proteínas do citoesqueleto. Neste estudo foram usadas células pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) de um paciente com LVNC e de um familiar saudável de 1º grau. Foram geradas células endoteliais e cardiomiocitos a partir das hiPSCs. Os cardiomiocitos foram gerados através da ativação da via WNT com a estimulação sequencial das células com CHIR99021 e a sua inativação com a suplementação de IWP2. A partir do sétimo dia de diferenciação os cardiomiocitos derivados das hiPSCs de paciente e controlo, que adquirem uma função contrátil autónoma, apresentavam diferenças observáveis. Principalmente no espaço temporal do aparecimento da contração espontânea e da área observável com batimento. O batimento espontâneo nas células de paciente mostrava um atraso de 2-3 dias, comparada com as células controlo. E ao fim de 14 dias de diferenciação foram observadas várias diferenças incluindo a área com batimento cardíaco e as estruturas formadas. Enquanto os cardiomiocitos controlo apresentavam uma área extensa e estruturas como uma rede, as células de paciente apresentavam pequenas áreas com batimento espontâneo e estruturas redondas. Foram realizadas recolhas de amostras celulares em diferentes estados de diferenciação, ao dia 1, 3, 5 e 8. Com as amostras foram realizados RT-PCR, para verificar se existiriam diferenças na expressão de mRNA dos genes NANOG, SOX2, OCT4, MESP1/2, BRACHYURY, VE-PTP, SNC5A, SCN10A, TNNT2, ZSCAN10, NKX 2.5, ISL1, KDR, GATA4, VEGFA, SOX17, NFACT1 e NFACT2. Neste ensaio foi verificada a existência de diferenças significativas na expressão de genes ligados à formação dos vasos sanguíneos que irrigam o coração. Nomeadamente, o VE-PTP, VEGFA, SOX17 e KDR. SOX17 apresentava uma expressão mais elevada nas células de paciente. Enquanto o mRNA relativo de KDR, VEGFA e estavam diminuídos nas células derivadas do paciente, ao dia 5. KDR é um receptor de VEGFA. KDR e VEGFA são dois genes essenciais para a formação de vasos sanguíneos. Genes ligados à diferenciação e proliferação de cardiomiocitos também se encontravam significativamente alterados (GATA4, NKX2.5, ISL1 e TNNT2). GAT4 forma um complexo com NKX2.5, que se vai ligar a regiões especificas de ISL1 para promover a expressão de genes para cardiomiocitos atriais e ventriculares. Se a sua expressão está diminuída significativamente, a diferenciação dos progenitores cardíacos poderá estar comprometida. As células endoteliais foram derivadas com a utilização de um kit comercial, o fenótipo das células foi confirmado por citometria de fluxo e imunofluorescência, com a luminescência do anticorpo superficial CD31. O ensaio de formação de tubos é um ensaio utilizado para verificar a capacidade angiogénicas das células. E neste estudo foi utilizado para verificar se existiriam diferenças nas capacidades das células endoteliais derivadas das hiPSCs do paciente com LVNC em formar tubos em comparação com as células do controlo saudável. Principalmente, por um dos genes mutados estar diretamente relacionado com a angiogénese de vasos sanguíneos cardíacos, o gene VE-PTP. As variáveis observadas foram o comprimento e tamanho das malhas, os nodos, os segmentos, ramificações das extensões e existência de segmentos não conectados e extremidades. O ensaio de formação de tubos foi realizado três densidades celulares diferentes (5 000; 10 000 e 15 000 células) e a formação observada até às 16 horas (h) (1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 16h). As imagens foram avaliadas através da extensão do Image J, “Angiogenesis Analyser”, e analisado o Fold Change das variáveis (das células paciente sobre as células controlo saudável). Foram verificadas mais diferenças significativas nas horas 3 e 4, com a verificação da presença de menos segmentos e mais curtos e verificou-se maior número de segmentos isolados, verifica-se uma maior dificuldade para as células formarem ligações. Presença de menos malhas e mais pequenas. O número de ramificações e o comprimento também foi menor. Estes resultados representam a capacidade angiogénicas das células do paciente, em que se pode verificar uma maior dificuldade para as células endoteliais do paciente se conectarem e formarem vasos e as redes interconectadas de vasos sanguíneos para uma boa irrigação sanguínea do coração. No geral, o resultado obtido na formação de tubos confirmou que algum mecanismo ligado á formação das células endoteliais ou relacionado com as junções aderentes, poderão estar comprometidos. Em específico, as células endoteliais derivadas das células do paciente apresentarem uma organização mais deficiente em comparação com as células controle. E os genes relacionados com a angiogénese estão significativamente diminuídos comprovam a existência de um mecanismo angiogénico mutado. Futuros testes a proteínas expressas por estes genes, que poderão estar alteradas, são necessários para confirmar o fenótipo.
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Keywords
Congenital heart disease Left ventricular noncompaction Differentiation Cardiomyocyte Angiogenesis